锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA,是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验.在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下,取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤,并达到研究相关基因表达的目的.本研究利用TRizol法提取RNA,获得的各样品RNA条带完整、纯度高.结果表明,4种保护性组织提取的RNA经过逆转录反应,得到了高质量的CDNA.内标基因(β-actin)、热激蛋白基因(hsp 70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带,通过NCBI数据上的BLAST比对证明,各序列的同源性在95%以上.利用本研究的方法,可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性,用于进一步的分子生物学研究.     

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立

本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。     

刺参组织总RNA提取的研究

利用Trizol法和两种RNA提取试剂盒对刺参的肠、呼吸树、纵肌、体壁等不同组织总RNA进行了提取。综合分析结果表明,F试剂盒提取刺参组织总RNA的效果较其他两种方法而言方法最适宜,能获得纯度高、污染少,而且无降解的高质量总RNA。刺参的肠组织富含RNA,且质地较软容易研磨彻底,是提取总RNA的最佳组织,可获得量大、质优的总RNA。     

黄河鲶不同组织中RNA提取纯化方法研究

从组织提取RNA的完整性对于分子生物学研究是至关重要的。RNA提取方法有多种。采取异硫氰酸胍法从黄河鲶肌肉、血液、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢中提取出完整RNA,结果表明,通过该方法所提取RNA质量高,效果好,可以用于进一步的分子生物学研究。     

长江华溪蟹组织RNA提取的研究

比较了长江华溪蟹Sinopotamon yangtsekiense心脏、肝胰腺、鳃和性腺等组织中提取总RNA的4种方法,同时比较了同一方法提取不同组织RNA的质量,总结出适合于蟹类组织RNA提取的方法.结果表明,TRIzol法提取效果最好,心脏总RNA质量最高.此外,实验中提取的总RNA污染少、完整性好,为以后进行cDNA合成、基因表达及定量分析等研究奠定了基础.     

鳜鱼病毒核酸随机引物扩增与克隆↑（*）

从感染鳜鱼病毒（ Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｃｈｕａｔｓｉ Ｖｉｒｕｓ,简称ＳＣＶ） 的鳜鱼体中分离病毒,提纯核酸作模板。通过ＲＡＰＤ 法,用带酶切位点的引物进行病毒核酸随机引物扩增,获得扩增带谱。从带ＥｃｏＲⅠ酶切位点的引物扩增产物中,用琼脂糖凝胶电泳回收大小约为０ ．４ 和０ ．５ Ｋｂｐ 的片段,经ＥｃｏＲⅠ酶切处理制备成带粘性末端的片段,分别插入质粒ｐＵＣ１９ 的ＥｃｏＲⅠ位点。ＥｃｏＲⅠ酶对重组子进行了酶切鉴定,获得２ 种带插入ＳＣＶ 核酸ＰＣＲ扩增产物的重组子。     

盐酸沙拉沙星在锦鲤体内的组织残留研究

健康锦鲤以15 mg/kg的单剂量肌肉注射给药,采用反相高效液相色谱法测定取给药后不同时间的肌肉、肾脏和肝胰脏中盐酸沙拉沙星的质量浓度,用MCPKP软件进行数据处理和分析。结果表明,盐酸沙拉沙星在肾脏、肝胰脏和肌肉组织中的代谢动力学特征不一。肌肉的代谢动力学模型为一级吸收二室开放模型,在肝脏和肾脏组织中代谢动力学模型为一级吸收一室开放模型。数据经回归处理得到3种组织的消除半衰期T1/2肌肉为55.44 h;T1/2肝脏为13.0755 h;T1/2肾脏为33 h。通过休药期公式计算各组织的理论休药期为:肌肉:11.0 d;肝脏:6.6 d;肾脏:9.5 d。以残留量高、消除最慢的组织作为残留分析的靶组织,建议锦鲤以肌肉为残留靶组织,在25℃的条件下,肌肉以10μg/kg为最高残留限量,建议休药期为11 d。     

锦鲤酪氨酸酶基因序列分析及在不同锦鲤品系的组织表达

为了解色素控制基因与体色分布的关系,实验用分子克隆技术得到了锦鲤酪氨酸酶(tyrosinase, Tyr) cDNA 基因序列, 并利用半定量PCR的方法分析了酪氨酸酶基因在锦鲤不同品系和组织中的表达差异。实验得到了长约1 779 bp锦鲤酪氨酸酶cDNA基因, 其包括长1 608 bp开放阅读框, 编码535个氨基酸。cDNA、蛋白水平序列分析和系统发育分析都表明酪氨酸酶在鱼类间的保守性要高于鱼类与其他脊椎动物间的保守性。半定量分析研究显示,酪氨酸酶基因在皮肤、肝、心、脑和眼中都有表达, 其中眼部和黑色皮肤表达最高, 其次是脑, 红色和黄色皮肤, 肝和心的表达最低。不同品系同组织间眼、肝、心、脑的酪氨酸酶基因表达差异不显著, 但是在皮肤中有差异表达, 黑色皮肤表达最高, 其次是红色和黄色皮肤, 在白色皮肤中也有少量表达。酪氨酸酶基因在非黑色组织中有较高表达可能与存在多种形式酪氨酸酶有关, 也有可能非黑色素细胞能转化为黑色素细胞。     

鱼类基因组DNA提取方法的优化及PCR扩增

以海水鱼军曹鱼为材料,分别采用4种不同处理方法———经典蛋白酶K法、CTAB法、改良SDS法及优化的一步法(ROSE)等提取基因组DNA,通过紫外分光光度计测定OD260/280值、琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示这4种方法均可以获得较高质量的基因组DNA,该基因组DNA用于目的基因的PCR扩增,均能得到PCR扩增的特异条带。改良SDS法及优化的一步法更加方便、快捷,而且成本低廉。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

盐酸沙拉沙星在锦鲤体内的药物动力学研究

用反相高效液相色谱法研究了盐酸沙拉沙星肌注给药(15 mg/kg)在锦鲤体内的药动学变化规律;用高效液相色谱仪测定取给药后不同时间的锦鲤血浆中盐酸沙拉沙星的质量浓度。用MCPKP药物动力学软件程序处理肌肉注射的血浆药物浓度与时间数据。房室模型分析表明,健康锦鲤肌肉注射给药的药时数据适合一级吸收一室开放模型,血浆中主要药物动力学参数为:Ka(1.660±0.467)/h;Ke(0.0859±0.0031)/h;T1/2Ka为(0.440±0.107)h;T1/2Ke为(8.069±0.276)h;Tm ax为(1.936±0.329)h;Cm ax为(3.290±0.888)μg/m l;AUC为(45.257±0.631)mg/(L.h)。盐酸沙拉沙星在健康锦鲤体内的主要药动学特征为:吸收迅速,达峰时间短,消除缓慢,体内滞留时间长。     

Effect of Probiotics on Growth Performance of Koi Carp (Cyprinus carpio)

A 45-day feeding experiment was conducted to measure the effects of enhancing the diet of koi carp (Cyprinus carpio) fingerlings with lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus (LAD) and/or brewer's yeast, Saccharomyces cervisiae (SCD). Fish with an average initial weight of 0.26g were fed one of four diets prepared for this study as follows: Diet 1 = basal diet (control); Diet 2 = basal diet + 0.5% LAD; Diet 3 = basal diet + 0.5% SCD; and Diet 4 = basal diet + 0.25% LAD + 0.25% SCD. Significantly (P < 0.05) highest growth rate was achieved in diet 3 followed by diet 4, diet 2, and diet 1. The highest gut microbial load and total heterotrophic count were also higher in diet 3 followed by diet 4, diet 2, and diet 1. Incorporation of 0.5% of brewer's yeast in the basal diet significantly (P < 0.05) improves growth performances and gut microbial load in koi carp.     

应用荧光标记通用引物检测鲤鱼(Cyprinus Carpio)微卫星基因型

应用荧光标记通用引物检测微卫星是一种省成本、省时间、高效精确的基因型检测方法。本文介绍了该方法的基本原理和操作流程,并首次应用此方法检测鲤微卫星标记的基因型。结果显示,除位点HLJ179未检测到有效数据外,其它14个位点都采集到相应的基因型。该方法在鲤微卫星基因分型上的成功应用,为今后鲤大规模连锁分析提供了一种更经济有效的检测方法。     

雌核发育橙黄色锦鲤的遗传、性腺发育及外形等特征研究

用经紫外线灭活的团头鲂精子激活橙黄色锦鲤的卵子,在4℃的水温下冷休克处理卵子30 min使其染色体加倍,获得了孵化率为30.6％、存活率为24.2％的雌核发育锦鲤,表明该雌核发育锦鲤研制方法具有较高的效率.利用外周血细胞培养方法制备了雌核发育锦鲤染色体并利用核型分析方法对其核型进行了分析,发现雌核发育锦鲤染色体数目为100,核型公式为22 m+34 sm+22 st+22 t;表明雌核发育锦鲤为二倍体,其核型与锦鲤母本一致.利用石蜡切片方法,随机选取10尾1龄雌核发育锦鲤性腺进行检测,发现其性腺全部为卵巢;并且在繁殖季节随机检测100尾2龄雌核发育锦鲤,没有l尾能挤出精液,表明雌核发育锦鲤全部为雌性,为证明雌性锦鲤的性别决定类型为XX提供了重要证据.此外,还对雌核发育锦鲤与母本的的SOX基因遗传关系、外形、体色等进行了比较,结果表明雌核发育锦鲤与母本有相同的SOX基因扩增片段,为证明其为雌核发育锦鲤而非杂交后代提供了重要证据;同时,雌核发育锦鲤保留了母本体态优美的特点,且具有色泽更鲜艳等优点,表明该雌核发育方法产生了遗传改良效果.雌核发育锦鲤的获得为该观赏鱼的提纯复壮、遗传改良以及性别决定和性别控制研究奠定了基础.     

Effects of pyridoxine on antioxidative parameters in juvenile Jian carp (Cyprinus carpio var. Jian)

To investigate the effects of dietary pyridoxine (PN) on antioxidant status of fish in serum, intestine and trunk kidney, 1050 juvenile Jian carp (11.7 ± 0.1 g) were used for the experiment. The carp were divided into seven groups and fed diets containing graded levels of PN (0.20, 1.71, 3.23, 4.96, 6.32, 8.58 and 12.39 mg kg^?1 of diet) for 80 days. Results of the study showed that content of malondialdehyde in serum, intestine and kidney tissues was the highest when fed the diet containing 1.71 mg PN kg^?1 diet (P < 0.05). Meanwhile, the protein carbonyl content of intestine and kidney tissue showed a downward trend to a point (P < 0.05). Conversely, activities of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase (GSH‐Px), glutathione S‐transferase, glutathione reductase and glutathione (GSH) content in serum, intestine and kidney tissue were generally higher in PN‐supplemented diets than unsupplemented diet (P < 0.05). The present results indicated that the PN decreased lipid peroxidation and protein oxidation in fish, and partly because of its improved antioxidant enzymes activities and levels of GSH.     

利用OneMap软件构建鲤遗传连锁图谱

首次使用R环境中的OneMap软件包,以荷包红鲤抗寒品系(♂)和云南大头鲤(♀)为祖父母本所培育的110个F2个体为作图群体,以荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplification fragment length polymorphism,fAFLP)为主要分子标记,采用远交全同胞家系模型构建鲤的遗传连锁图谱。结果显示,110个F2个体中共产生1513个清晰的fAFLP标记,其中多态性标记911个;另开发多态性的EST标记12个,最后总计923个标记用于构建遗传连锁图谱;采用OneMap软件包构建的遗传图谱含有238个fAFLP标记和8个EST标记分布在50个连锁群上,总图距为2876.64cM,标记间平均间距为14.68cM,图谱覆盖率为66.56%。     

棉酚对鲤鱼急性中毒的研究

鲤鱼（体重约16克）腹腔注射乙酸棉酚0，7．3，54，100，200，400mg/kg体重，经四天（96小时）后，死亡率分别是0，0，20％，70％，90％，100％。96小时半数致死剂量是63．6mg/kg体重。注射剂量高于54mg/kg体重时，发生腹腔红肿、体壁溃烂，甚至死亡。实验结果说明虽然棉籽水平的棉酚不引起鲤鱼的任何可见的中毒症状，但是腹腔注射大剂量棉酚可引起与哺乳类相似的中毒症状。