虾夷扇贝胚胎及早期幼虫酯酶和过氧化物酶的组织化学研究

采用组织化学的方法对虾夷扇贝从卵细胞到D形面盘幼虫内的酯酶(NSE)和过氧化物酶(POD)进行定性定位研究。试验结果表明,NSE和POD均广泛存在于虾夷扇贝的胚胎和幼虫中,自卵细胞开始就已存在。从卵细胞到原肠胚均呈比较均一的NSE强阳性或POD阳性。在担轮幼虫期,中央的内脏团原基呈NSE极强阳性或POD强阳性,其余细胞则呈NSE强阳性或POD阳性。D形面盘幼虫期,外套膜和内脏团呈NSE极强阳性或POD强阳性,其余部位则呈NSE强阳性或POD弱阳性。     

长牡蛎胚胎和早期幼虫非特异性酯酶和过氧化物酶的组织化学研究

采用组织化学方法对长牡蛎(Crassostrea gigas)胚胎和早期幼虫中的非特异性酯酶(non-specific esterase,NSE)和过氧化物酶(peroxidase,POD)进行定位研究,以探讨贝类胚胎和幼虫发育过程中的免疫防御机制.组织化学显示,NSE和POD均广泛存在于长牡蛎的胚胎和幼虫中,自卵细胞开始就已存在.NSE和POD在各个发育时期分布和含量不同,精子呈极弱的NSE和POD阳性;未受精的卵呈强阳性,但酶在细胞内的分布不均匀,核区颜色较浅;2至32细胞期细胞内酶的分布较均匀;桑葚期、囊胚期、原肠期以及担轮幼虫和早期面盘幼虫期不同细胞间酶的强弱有差异.在胚胎发育前期显色较深,呈强阳性,表明此2种酶的活性较高;发育至后期颜色变浅,呈弱阳性,表明酶的活性降低;幼虫期酶活性有增强的趋势.     

水温对石磺胚胎发育的影响

通过实验室研究，对石磺（Onchidium sp．）胚胎发育过程进行了详细观察，比较了不同水温下石磺胚胎发育的速度，探讨了膜内面盘幼虫孵化出膜的主要条件。结果表明：石磺的胚胎发育过程类似于肺螺亚纲其他贝类，行体内受精，刚产出的卵为受精卵，细胞未进行分裂，卵裂从卵产出体外开始，分别经过卵裂期，囊胚期，原肠期，膜内担轮幼虫期，膜内面盘幼虫期，经过孵化期孵化出膜为自由生活的面盘幼虫期。对各阶段幼体的大小、形状、内部器官等特征以及发育变态过程进行了详细的显微观察和描述。26℃，28℃，30℃3个水温组中，从受精卵到膜内面盘幼虫孵化出膜分别需要300h，290h，288h；发现影响幼虫孵化出膜的主要因素是水温和海水的刺激作用；繁殖盛期卵群工厂化水泥池自然水温孵化时间为10～14d。并报道了水温低于23℃时石磺胚胎停止发育现象。     

Foxl2基因在栉孔扇贝发育过程中的表达图式

Foxl2基因在哺乳动物中是雌性相关基因,参与卵巢发育和功能维持。本研究利用荧光定量PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2(Cf-foxl2)在发育过程中的表达图式进行了分析。研究发现Cf-foxl2在受精卵中呈低水平表达,随着发育进行表达量增高,D形幼虫期表达量最高,之后表达量迅速下降。原位杂交结果显示Cf-foxl2表达量在担轮幼虫之前在体内均匀分布;强阳性信号在担轮幼虫口凹附近呈对称分布;至D形幼虫期强阳性信号主要集中在内脏团和外套膜边缘处;之后信号消失,直到性别分化后在卵巢中再次出现。本实验结果暗示Cf-foxl2与卵巢发育相关,鉴于该基因在发育早期的持续性表达特征,暗示其可能参与栉孔扇贝的早期发育过程。     

脉红螺早期发育的形态观察

在实验室条件下孵化脉红螺的卵囊,观察其胚胎和浮游幼体发育过程,及脉红螺早期发育过程的形态学变化。卵囊在25 ℃时孵化时间为16 d,经过卵裂期、囊胚 期、原肠胚期、膜内担轮幼虫期,最后发育为膜内面盘幼虫,破膜而出开始浮游幼体发育阶段。脉红螺浮游幼体期按螺层、面盘形态、幼体壳型和器官可分为5个 时期,分别为1螺层期;2螺层期(初期、中期、后期);3螺层期初期;3螺层中后期;4螺层期(初期、中期、后期)。其中在2螺层后期幼体的生长速度最快,壳高平均 每天增加44.45 μm,3螺层初期幼体的生长速度最慢,壳高平均每天增加19.51 μm。脉红螺附着变态的时期是4螺层中期和后期,壳高1 250～1 500 μm,附着变 态的标志是浮游幼体壳口边缘明显加厚并向壳口外侧翻转,壳口中央突起部消失,面盘退化,足部发达并能自由伸缩。     

河川沙塘鳢(♀)与云斑尖塘鳢(♂)杂交子代胚胎发育研究

以河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为母本、云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)为父本进行科间人工远缘杂交,对杂交子代胚胎发育情况进行了观察和记录,描述了各个发育阶段的形态特征。结果显示:杂交子代的胚胎发育可分为受精、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、体节、鳃、孵化期8个阶段。根据每个阶段的形态建成以及发育特点,分为31个主要时期,卵裂阶段从2细胞期至32细胞期和桑葚期;囊胚阶段有囊胚早期、囊胚晚期;原肠阶段有原肠早期、原肠中期、原肠晚期;神经胚阶段有神经胚早期、神经胚晚期;体节分化阶段从2体节期到41体节期;鳃阶段又可分为消化系统形成期、肝脏形成期、鳃裂期以及脾脏和口裂形成期;最后的孵化期分为出膜前期、出膜期。在温度为(20±2)℃的孵化条件下,杂交子代的受精卵经501 h孵出仔鱼。     

近江牡蛎受精过程、胚胎及早期幼虫发育特征

为了解近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)从受精到早期幼虫发育阶段的发育特性，在水温22～24℃、盐度20～22的实验室环境中对采自山东东营丁字湾海域的近江牡蛎进行人工授精，利用普通光学显微镜和荧光显微镜对近江牡蛎受精、早期胚胎和幼虫发育过程中的形态和核行为变化进行观察，并对这一过程中牡蛎的壳长变化进行了统计分析。结果表明，近江牡蛎成熟的未受精卵呈梨形，卵径为50μm左右，核相处于第一次成熟分裂中期。受精卵在受精后15～20 min、25～30 min,先后排出第一、第二极体，完成第一次和第二次成熟分裂，在受精后30 min左右先后形成雄原核和雌原核；雌、雄原核各自形成染色体组，在卵子中央发生联合，染色体排列于赤道板上，形成第一次有丝分裂的中期分裂相；受精后45 min左右，受精卵进行第一次卵裂，形成2个体积不等的卵裂球；受精75 min后，受精卵开始第二次卵裂，90 min后形成4个卵裂球，进入4细胞时期；6 h后受精卵发育至桑葚期，8～10 h进入囊胚期，12～15 h后发育至担轮幼虫，27～30 h左右发育成D形幼虫，5 d左右进入壳顶幼虫时期，17 d后幼虫...     

百草枯对尖膀胱螺的急性毒性

进行了百草枯(paraquat)对尖膀胱螺(Physa acuta)成体及其胚胎各发育期(囊胚期、担轮幼虫期、面盘幼虫期和仔螺孵化期)的急性毒性实验.结果表明,百草枯对尖膀胱螺成体72 h和96 h LC50分别为2.53 mg/L和1.41 mg/L;对其胚胎各个时期72 h LC50分别为2.63、2.45、2.07、1.53 mg/L;96 h LC50分别为1.63、1.41、1.25、0.60 mg/L.百草枯对尖膀胱螺成体及其胚胎各发育期均有一定的毒性效应,胚胎比成体敏感,对胚胎各发育期的毒性也不同;随着染毒时间的延长,胚胎敏感性逐渐增强.研究表明,当百草枯进入水生态系统时,有可能对尖膀胱螺及其种群稳定造成影响.     

施氏鲟卵巢发育的组织学观察

对人工养殖施氏鲟卵巢发育的不同时期(1～8龄)进行了组织学观察,结果表明：1龄施氏鲟处于性分化早期,卵巢中卵原细胞形成增殖团;2～3龄鱼卵巢为Ⅰ期,第1时相的初级卵母细胞直径10～60μm,核大,位于细胞中央,染色质均匀分布;4～5龄卵巢为Ⅱ期,第2时相小生长期的初级卯母细胞直径60～200μm,核内含有7～26个核仁;6～7龄卵巢Ⅲ期,第3时相大生长期的初级卵母细胞直径200～1600μm,卵母细胞内出现脂肪滴、卵黄颗粒和色素颗粒。细胞膜有完整的3层结构。8龄卵巢Ⅳ期,第4时相晚期初级卵母细胞直径1600～3300μm,细胞核膜消失,核仁溶解,核由中心向动物极受精孔移动;V期卵巢的第5时相生殖细胞为成熟的卵细胞,直径3400～3750μm,从滤泡膜中释放到体腔内;Ⅵ期为产卵后的卵巢,以第2时相的卵母细胞为主：根据研究结果推测,施氏鲟卵巢再次成熟的周期为3～4年。     

黄海北部大连沿岸虾夷扇贝天然苗采集技术研究

在调查了2005、2006年黄海北部大连海域虾夷扇贝的繁殖期、浮游幼虫的时空分布的基础上,对虾夷扇贝海区天然采苗进行了研究。结果表明,2005、2006年该区域的獐子岛海域、大长山岛海域、广鹿岛海域养殖的虾夷扇贝的繁殖期在4月初至5月上旬,盛期在4月15～25日。4月上旬至6月中旬,在此区域均可发现大量的虾夷扇贝浮游面盘幼虫,不同区域浮游幼虫密度变化很大。5月底至6月初是面盘幼虫集中的附着变态时期,在海区投放附着袋可进行虾夷扇贝天然苗的采集。从各海区虾夷扇贝浮游幼虫的拖网调查和采苗结果看,在虾夷扇贝主要养殖区獐子岛、大长山岛海域和广鹿岛海域,浮游幼虫在浮游的初始阶段能够形成较高的密度,但在附着阶段密度极低,不能采集到大量苗种,但在远离虾夷扇贝养殖区的大李家湾和凌水湾,浮游幼虫的出现比养殖区晚,在幼虫附着期能达到较高密度。能够采集到大量天然苗种。2005年在凌水湾的采苗数量达526±131个/袋(壳长0.6～1 mm),2006年在大李家湾的采苗数量达673±200个/袋(壳长0.6～1mm)。     

卵形鲳鲹碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的分布及其低温保存

测定了卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）在不同器官和肌肉中的活性;将样品分别置于4℃、-20℃和-80℃下保存3 d、7 d、15 d和30 d,研究不同保存温度和保存时间对样品中AKP和ACP酶活性的影响。结果表明,在卵形鲳鲹胃中未检测到AKP活性,其他器官中均检测到AKP活性,AKP活性大小顺序依次为后肠〉幽门盲囊〉肾〉中肠〉肝〉前肠〉心〉肌肉;ACP在卵形鲳鲹体内分布较广,所测器官中均有ACP活性,其活性大小顺序为肝〉肌肉〉后肠〉中肠〉幽门盲囊〉肾〉心〉前肠〉胃。低温保存试验结果表明,AKP和ACP在4℃和-20℃下保存,时间越长,活力越低;在-80℃下保存,AKP和ACP活力在30 d内基本稳定,只有幽门盲囊的AKP和ACP在长时间保存后活力明显下降。     

黑龙江茴鱼胚胎的发育及仔、稚、幼鱼的生长

采用Bouin氏液固定、剥离卵膜的方法对黑龙江茴鱼(Thymallus arcticus grubei Dybowski)的胚胎发育及孵出后仔鱼卵黄囊的吸收情况进行了观察,同时测定65日龄内的仔、稚、幼鱼生长状况。结果显示:黑龙江茴鱼卵是典型的端黄卵,其卵裂方式为盘状卵裂。胚胎发育可分为22个期,包括受精卵、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、多细胞期、囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期、原肠早期、原肠中期、原肠晚期、神经胚期、胚孔封闭期、眼囊出现期、胸鳍芽出现期、晶体出现期、眼色素沉积期、循环期和出膜期,至发眼(晶体出现期)需75.84℃.d,至破膜需117℃.d;受精卵膜较鲑科鱼类薄而柔软,胚体头尾绕卵黄囊超过一周,晶体出现在眼色素沉积期之前;仔鱼卵黄囊的体积随着日龄的增加而逐渐减小,4日龄前吸收较快,此后吸收相对较慢;仔鱼在240℃.d(11日龄)左右时出现鳔并开始上浮,260℃.d(16日龄)左右时开口;积温达到346.9℃.d(20日龄)时卵黄囊完全被吸收,仔鱼期结束,进入稚鱼期;稚鱼在36日龄之前生长相对较缓慢,在36日龄后增长较快;在积温达到546.3℃.d(38日龄)时,稚鱼奇鳍褶开始退化,进入幼鱼期。     

“红肉病”文蛤的组织病理学

利用组织学和组织化学方法,在光镜水平下研究了患“红肉病”文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)的组织病理学变化特征。结果显示,患病文蛤的病理学变化主要表现为组织结构紊乱,上皮膨大、脱落,鳃、外套膜、消化盲囊等组织发现异常结构及寄生物,如嗜碱性的包涵体、嗜酸性颗粒及寄生性原生动物等。另外,组织化学研究结果显示,病蛤在糖含量、磷酸酶活性等方面也有明显变化,表现为消化盲囊、肠等部位吸收细胞内糖含量增加。消化盲囊、消化管各处酸性磷酸酶(ACP)活性减弱,碱性磷酸酶活性(AKP)增强。鳃组织ACP活性增强,AKP活性减弱等。     

多棘海盘车胚胎和早期幼虫发育

对室内培育的多棘海盘车Asterias amurensis胚胎和幼虫的发育以及外部形态进行了显微观察。多棘海盘车为雌雄异体,体外受精,成熟卵卵径为(130~150)μm,卵裂属完全均等型。水温为(10.5~11.5)℃时,受精卵经20min左右释放第1极体,约50min进行第1次卵裂,约7h时进入桑葚期,19h40min发育成为膜内旋转囊胚,23h40min发育成为脱膜旋转囊胚,26h30min发育成为早期原肠胚,纤毛幼虫(初孵幼虫)出现在46h,从受精到短腕幼虫历时25d。由纤毛幼虫到短腕幼虫的过程中幼虫体长经历了先增大后减小的过程。进一步发现,投喂混合饵料(小新月菱形藻Nitzschia closteriumf.minutissima和海洋红酵母Rhodomonas sp.1∶1)的幼虫发育速度比单独投喂小新月菱形藻的快,但差异不显著(P0.05)。     

雅砻江鲈鲤的人工繁殖、胚胎及卵黄囊仔鱼发育

采用不同配伍的外源激素对培育成熟的野生鲈鲤进行人工催产,并对其胚胎和1-10日龄卵黄囊仔鱼的发育进程进行详细的观察和描述。注射促黄体素释放激素类似物A2、地欧酮和绒毛膜促性腺激素的鲈鲤亲鱼组的催产效果明显好于注射鲤鱼脑垂体和促黄体素释放激素类似物A2的亲鱼组,效应时间为58h,平均受精率和平均孵化率分别为87.33%和90.75%。在水温(16±2)℃条件下,鲈鲤胚胎发育历时117.83h,所需积温为1855.33℃·h,出膜10d后仔鱼开始平游。鲈鲤胚胎发育分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期和出膜期7个阶段,共26个时期。分析发现,在人工催产配伍激素中添加适量的绒毛膜促性腺激素,有助于鲈鲤亲本顺利排卵;鲈鲤卵黄囊仔鱼在孵化出膜后的前5d处于内营养阶段,第6d起转入混合营养阶段,为仔鱼培育的第一危险时期。     

糙海参胚胎和幼体发育的形态观察

为提高糙海参育苗技术,研究描述了糙海参从受精卵发育到稚参的形态变化,在显微镜下测定了受精卵、胚胎和幼体的大小,确定了糙海参胚胎发育的过程。结果表明,通过利用阴干、流水刺激法对成熟亲参进行人工催产,得到大量的受精卵,其受精率为90%以上。糙海参胚胎和幼体发育可分为受精卵、卵裂期、囊胚期、旋转囊胚期、原肠期、初耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽形幼体和稚参等阶段;在平均水温29℃,平均盐度34条件下,糙海参受精卵经3 h发育形成囊胚,4 h进入旋转囊胚期,5 h进入原肠期,19 h完成胚胎发育变态为耳状幼体;并经过7 d的生长与发育进入樽形幼体;第15天变态为稚参。观察发现,多精入卵现象则会导致胚胎发育不正常,最终使胚胎发育停止并死亡。在糙海参幼体发育过程中,大耳状幼体期幼虫臂的大小及其球状体的形成均可作为判断其幼体发育健康状况的重要指标:幼虫臂越大,球状体出现率越高,其幼虫的变态率和成活率也越高。对比发现,位于糙海参尾部的突出结构——尾突,为仿刺参和新西兰刺参所没有,这一结构差异同时导致了其骨片位置也不同;并且,糙海参胚胎和幼体与其他种类的海参在发育时间上存在一定差异。     

A3α-肽聚糖对凡纳滨对虾磷酸酶及细胞内酚氧化酶活性的影响

为考察A3α-肽聚糖(Peptidoglycan,PG)在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的养成期对其免疫酶活性的影响,设立了连续投喂、间隔投喂和浸浴共6个实验组。连续投喂组中PG的添加量分别为0(对照)、0.01%、0.05%和0.1%;间隔投喂组中PG的添加量为0.05%;浸浴组的给予方式为50mg/ml,3h/次/15d。分别在30、60和90d时,测定对虾体内及血浆上清中的酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性,另外,在60d和90d时,测定对虾血细胞内酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活性。结果表明,30d时,PG浸浴组、0.05%和0.1%PG添加量组的ACP活性,各PG作用组的AKP活性均较对照组高,且0.1%PG添加量组的ACP活性及0.05%和0.1%PG添加量组的AKP活性较对照组增长显著(P<0.05);60d时,除间隔投喂组外,各组的ACP活性均较对照组高,且0.1%PG添加量组增长显著(P<0.05),而各实验组的AKP活性均较对照组高,且0.05%PG添加量组增长显著(P<0.05),除浸浴组外,各组血细胞内PO活性均有提高;90d时,浸浴组和间隔组的ACP和AKP活性均较对照组高,且间隔投喂组的AKP活性增长显著(P<0.05);间隔投喂组的血细胞内PO活性较对照组有增长。实验证明,PG能激活对虾的免疫力,并可作为免疫增强剂应用于对虾的生产。     

罗氏沼虾胚胎附着机制的初步研究

甲壳动物十足目的大多数种类,其受精卵自产出后就附着于亲体腹部,并完成胚胎发育过程直至孵化,这对于胚胎的发育、保护和幼体散布有重要的生物学意义。胚胎的附着机制较为复杂,与刚毛、卵柄、卵索、卵膜和黏液腺有关:卵柄和卵索的形成决定了胚胎发育的顺利进行;卵膜的变化影响着胚胎的附着;黏液腺在胚胎附着过程中形成卵柄和外层卵膜,胚胎是依靠卵柄或卵索附着于腹肢的刚毛上,进而完成胚胎发育过程。本研究采用常规组织学和扫描电镜的方法研究了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)胚胎及其附着结构。结果表明,胚胎附着与母体腹肢的结构、黏液腺分泌的黏液相关,也与胚胎表面结构、次级卵膜的形态和结构密切相关。原肢底节和内肢刚毛密而长,基部有细小的分支,有利于胚胎的附着,外肢刚毛羽状则有利于胚胎的托附和保护。抱卵雌虾腹肢的原肢和内肢上布满腹肢黏液腺分泌的黏液;携卵刚毛中空、壁厚,刚毛外壁由微绒毛状结构组成,扩大了携卵刚毛的表面积,以利胚胎附着。胚胎外表面由初级卵膜和次级卵膜组成,次级卵膜主要由卵巢黏液腺分泌的黏液参与形成。排卵时,受精卵依靠坚韧的次级卵膜相互粘连,同时,部分受精卵在刚毛上滑动、旋转,并借助次级卵膜逐渐形成了卵柄或卵索固着在腹肢刚毛上。从受精卵到胚胎孵化,胚胎之间最主要的连接方式是依靠次级卵膜的连接。胚胎的表面有许多褶皱和黏液,利于胚胎的附着以及胚胎对溶氧和小分子物质等的通透。以上结构与附着相适应,保证了胚胎发育的顺利进行和幼体的正常孵化。本研究旨为进一步认识甲壳动物胚胎附着机制、胚胎发育和人工育苗的研究提供参考。[中国水产科学,2007,14(1):67-73]     

单环刺螠Vasa基因的早期发育表达图式

Vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶,是决定生殖系发育的重要调控因子之一。采用同源克隆策略及SMART-RACE技术,克隆了海洋经济螠虫动物单环刺螠Vasa基因的全长cDNA,该序列长4 080 bp,开放阅读框2 322 bp,编码733个氨基酸,具有DEAD-box蛋白家族共有的全部9个保守域。整体原位杂交和半定量RT-PCR结果显示,Vasa基因在未受精卵、受精卵、2～8细胞的早期胚胎中均有明显的表达,显示其母源性提供的特点;从囊胚开始,表达量明显降低,在原肠胚表达信号主要集中在内中胚层细胞中;至担轮幼虫,表达信号进一步集中在消化道处;当发育至体节幼虫时,阳性细胞分布于消化道和体节的隔膜处,进入蠕虫状幼虫,信号仅在头部的腹刚毛附近以及后肠周围的细胞中表达。实验结果为探知刺螠动物生殖系的起源和分化以及低等型生殖腺的发生提供重要的数据。