剑尾鱼RW-H近交系20个微卫星位点的遗传结构

为了对水生实验动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)RW-H系近交15代的遗传结构进行研究,寻找该近交系的标志基因位点,选择20个在野生剑尾鱼群体具多态性的微卫星位点,对剑尾鱼RW-H系(红眼白体)30尾个体进行分析。结果表明,其中有17个位点为单态,有可能作为该近交系的标志基因位点;另外3个位点Msa012、Msa033和Msc036具有多态性,多态信息含量值分别为0.3047、0.3457和0.3648。通过Pop-gene 3.2软件分析得知全部基因位点的纯合率达到了95.83%,个体间平均遗传距离为0.0482(0.000 0~0.1625),遗传相似系数为0.9518(0.8500~1.0000),说明剑尾鱼RW-H系已经具有很高的近交程度。几个多态性位点的发现,可以指导近交选育,加快选育进度。本研究方法不仅检测出剑尾鱼RW-H系具较低的遗传多样性,而且可为中国建立分子水平的实验动物监测标准提供基础数据。     

微卫星标记在RR-B系剑尾鱼遗传监测中的应用

采用49对微卫星引物对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育系剑尾鱼进行PCR扩增，有46个微卫星座位能获得稳定的扩增产物，7个微卫星座位能区分RR-B系与非选育群体剑尾鱼。7个微卫星座位在选育系剑尾鱼为单态纯合，而在非选育群体具有多态性，座位Msa014鉴定RRB系剑尾鱼排除概率最高，为98.75%，座位Msd003排除概率最低达到了87.50%，其余5个座位排除概率介于两者之间。为方便今后的遗传监测，对RR-B系剑尾鱼样品的7个微卫星座位进行了测序，确定了其大小和具体的微卫星结构。本实验建立了RR-B系剑尾鱼分子检测方法，为实验动物剑尾鱼的遗传监测奠定了基础。图4表3参23     

微卫星分析鲤鱼杂交系F2代家系群体遗传多样性

利用10个微卫星分子标记,对8个鲤鱼杂交系家系进行遗传多样性分析,结果显示:10对微卫星引物在鲤鱼杂交系F2代8个家系共240个个体中均获得了稳定、清晰的扩增条带,并在个体间表现出不同程度的多态性。共检测到59个等位基因,位点等位基因数在3~9个,平均等位基因数5.9个,片段长度在129~371 bp,有效等位基因在1.533~5.821,平均为3.452 5;观测杂合度在0.421~0.882,平均为0.647,期望杂合度在0.506~0.826,平均0.628;多态性信息含量(PIC)在0.452~0.815,平均多态信息含量0.675,为高度多态性;个体间遗传距离0.3586~0.8302,相似性系数在0.5012~0.7906。8个家系中,20号家系与59号家系的遗传距离最小,为0.357 3;20号家系与35号家系遗传距离最大,为0.830 2。实验结果表明:该鲤鱼杂交系F2代群体遗传多样性水平较高,等位基因数量较多,杂合度较高,多态信息含量丰富,家系间没有受到近交的影响,具有较大的选育潜力。     

剑尾鱼微卫星DNA的筛选

以剑尾鱼(Xiphophorus helleri)为材料,经MboⅠ限制性内切酶消化基因组DNA后,选取500～2 000 bp的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5α构建部分基因组文库.采用设计合成的(AC)7、(GT)7重复序列为引物,PCR筛选部分基因组文库,对其中9个重组阳性克隆进行测序,结果共获得24个微卫星序列,其中Perfect(完美型)13个,占54.2%;Imperfect(非完美型)3个,占12.5%;Compound(混合型)8个,占33.3%.表明(AC/GT)n在剑尾鱼的基因组DNA中含量非常丰富.同时,根据其中3个克隆微卫星的侧翼序列设计引物,PCR扩增剑尾鱼基因组DNA,结果均扩增到目的片段.而且,这3对引物扩增出来的微卫星片段在非选育的剑尾鱼中显示出多态性,而在近交系19代则表现为单态,为剑尾鱼的实验动物化遗传研究提供了理论依据.     

用微卫星标记分析湘华鲮野生群体遗传多样性

为了解湘华鲮天然种质资源现状，用38对鲤科鱼类微卫星引物对其群体进行全基因组扫描，结果筛选出15对能够获得稳定扩增条带的引物。以鲮鱼养殖群体为对照群体。在15个微卫星位点中，湘华鲮多态性位点9个，对照群体6个。通过分析湘华鲮微卫星位点PCR产物的电泳图谱，共检测到40个等位基因，每个位点的等位基因数目介于1～5之间，其平均等位基因数为2．67个，平均有效等位基因数为1．47个，平均观察杂合度为0．2289，平均期望杂合度为0．2730，平均多态信息含量（PIC）为0．2440，多数Hardy-Weinberg平衡偏离指数值偏离平衡值，与对照组无显著性差异。本研究表明湘华鲮野生种群结构不合理，遗传多样性低，种质资源处于危险状态。     

两个人工雌核发育系鲢近交F1遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对两个人工雌核发育系鲢近交F1遗传距离、遗传相似度及群体遗传多样性进行分析，用普通鲢和鲤作对照。结果表明：GSCⅠ、Ⅱ系近交F1系内个体间平均遗传相似度分别为0．9722、0．9807，高于对照鲢和鲤的0．9546、0．8727；两系近交F1的遗传多样性指数分别为0．0629、0．0529，低于对照鲢和鲤的0．1018和0．2132，表明GSCⅠ、Ⅱ系系内近交的F1保持了较高的纯度。LIPGMA和NJ系统树清晰反映了两个系近交F1与对照组个体问的相互关系。26个随机引物的RAPD扩增结果显示，5个引物OPG04、OPG17、OPP01、OPM11、OPM16可以扩增出区分两个系近交F1的特异标志带。     

青岛文昌鱼遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对青岛文昌鱼雌、雄各11条个体共22个样本进行遗传多样性检测。从40个寡聚核苷酸随机引物中筛选出17个扩增重复性好、条带清晰、特异性强的引物，对每个个体基因组DNA进行了扩增。得到RAPD产物的分子量在200～2200bp之间，产物总计127个位点，其中，多态位点60个(占47．24％)。计算个体间遗传相似系数平均为0．8656，个体间遗传距离平均为0．1344。用Shannon多样性指数量化的遗传多态度(Ho)，雄性群体(0．1912)高于雌性群体(0．1125)，平均遗传多态度(Hpop)为0．1519。文昌鱼遗传多态度所占的比例在群体内为0．2553，而雌、雄群体间为0．7447。在文昌鱼雌、雄个体RAPD产物中，两个电泳图谱上能读出明显的雄性特征带，估计可能与雄性文昌鱼具有异型性染色体有关，这与XY型性别决定机制相吻合。引物OPC12扩增产物250bp为雄性文昌鱼所特有，可能为区别性别的分子标记。用NJ法进行聚类分析，结果表明，22个个体明显按性剐聚成两类，文昌鱼雌、雄个体基因组间的差异较大。     

巨野生群体遗传多样性的 RAPD 分析

巨（Bagarius yarrelli）为云南特有的经济鱼类,利用随机扩增多态性 DNA（RAPD）技术对元江下游的河口巨野生群体进行了遗传多样性分析,在50条随机引物中筛选出19条多态性较好的引物,通过 PCR 扩增,19条引物在巨群体中共检测到67个位点,其中多态性位点66个,平均多态性位点比率为98．51％,个体间平均遗传相似系数为0．8909,个体间平均遗传距离为0．1176;群体 Nei′s 基因多样性指数为0．2916, Shannon 信息指数为0．4269,结果表明巨野生群体具有较高的遗传多样性。     

黄鳝微卫星引物筛选及其在保护遗传学上的应用

研究了远缘种鲤的微卫星引物对黄鳝的适用性。结果显示，31对鲤微卫星引物中有11对引物能对黄鳝DNA模饭扩增出特异性带谱。每对引物扩增的等位基因数在3～13个，平均每个位点有5．6个等位基因，显示了较高的多态性。其中引物P1最理想，其PCR扩增产物能区分来自湖南、广东和孟加拉3个不同地域的黄鳝种群。应用微卫星技术对3个不同地域的黄鳝基因组DNA多态性分析结果显示，湖南、广东和孟加拉黄鳝群体内平均相似率依次为95．5％，95.8％和93．5％，平均变异度依次为0．045，0．042，0．063。群体间的相似率及变异度分析显示：湖南黄鳝和广东黄鳝群体间平均相似率为91．0％，变异度为0．045；湖南黄鳝和孟加拉黄鳝群体间平均相似率和变异度分别为55．7％和0．443；广东黄鳝和孟加拉黄鳝群体间平均相似率和变异度分别为58．6％和0．414。综合微卫星分析结果、黄鳝的外形特征及地理位置，可以推测，广东黄鳝与湖南黄鳝为同一个生物种的不同地理种群，而孟加拉黄鳝为同属中另一个种。     

太平洋牡蛎微卫星引物对三角帆蚌的适用性研究

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国特有种，它形成的珍珠具有珠质光滑细腻、色泽鲜艳等方面的优点，是淡水蚌中育珠质量最佳者，已成为最主要的淡水养殖珍珠蚌。本研究选取已发表的32对太平洋牡蛎的微卫星引物在三角帆蚌基因组DNA中进行PCR扩增，探讨太平洋牡蛎的引物用于三角帆蚌基因组微卫星分析的可能性。通过优化PCR反应条件，筛选13对引物可在三角帆蚌基因组中扩增出特异性条带（占总数的4l％）；其中10对引物（占总数的3l％）在洞庭湖三角帆蚌小群体中即检测到了个体间等位基因的多态性，共出现40条多态性条带。10个位点杂合度大小在0．125到0．693之间，其中7个微卫星位点（Cgi-10，Cgi-22，Cgi-24，Cgi-26。Cgi-29，Cgi-30，Cgi-32）为高度多态性位点，杂合度大于0．500，而其余3个微卫星位点（Cgi-1，Cgi-18 and Cgi-25）杂合度小于0．500，为低度多态性位点。初步的结果表明，部分太平洋牡蛎的微卫星引物可以用于三角帆蚌基因组的分析，这为其它贝类微卫星标记的开发奠定了基础。     

7种观赏性剑尾鱼品种间杂交子代的体色及鳍形研究

7种观赏性剑尾鱼的自交、杂交,对其子代的体色(包括眼睛色彩)及鳍形等性状进行统计分析。试验结果表明,黑眼为显性基因控制,红眼为隐性基因控制,体色与眼睛颜色有一定的连锁关系;推测剑尾鱼体色遗传由数量性状基因参与控制;尾鳍燕尾相对于正常尾为显性,而且雄性尾鳍的燕尾和长臀鳍具有连锁性;高背鳍由显性基因控制,正常背鳍由隐性基因控制,拥有正常背鳍的个体,其基因型是隐性纯合,拥有高背鳍的个体,其基因型为杂合,初步推断显性纯合为致死基因型。     

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用１８株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致,另外,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射,与原代比较,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致,感染后死亡时间相对集中。水生实验动物剑尾鱼在检测鱼类细菌的毒力方面有较好的应用前景。     

剑尾鱼趋化因子CCL4和CCL19基因的克隆及嗜水气单胞菌感染对其组织表达的影响

趋化因子是一类能够吸引白细胞移行到感染部位的低分子量(8~10 ku)蛋白质,在炎症反应、非特异性免疫反应中具有重要作用。实验克隆了剑尾鱼2个趋化因子基因(CCL4、CCL19)c DNA序列,运用荧光定量PCR技术检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后肝、脾中的表达情况。结果显示,剑尾鱼CCL4和CCL19开放阅读框长度分别为294和333 bp,分别编码97和110个氨基酸,推导氨基酸序列均含有趋化因子CC家族标志性的4个半胱氨酸残基,与其他物种尼罗罗非鱼、鼠、狗、人、鸡的氨基酸序列相似性比较,CCL4相似度分别为71.1%、33%、33%、31%、23.5%;CCL19相似度分别为62%、26.9%、24.5%、26.6%、27.8%。在检测的健康剑尾鱼8个组织中,CCL4和CCL19均有表达,其中CCL4和CCL19均在脾脏中表达量最高;CCL4在肌肉和肠中表达量较低,而CCL19则在心脏中表达量较低。经嗜水气单胞菌感染后,CCL4在剑尾鱼头肾中12 h表达量达到最高,在肝脏中24 h表达量最高;CCL19在头肾和肝脏中均在24 h时表达量最高。研究表明,趋化因子CCL4和CCL19可能参与剑尾鱼机体免疫调节反应,在抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥了重要作用。     

四种淡水鱼的RAPD分析

用RAPD技术分析了四种淡水鱼-鲫鱼、鳊鱼、草鱼及鲢鱼的种间和种内的遗传变异。用30个随机引物进行了RAPD扩增，其中29个引物得到扩增产物，选取其中11个带纹清晰、多态性较丰富的引物的扩增图谱进行遗传距离的计算，并进行聚类分析，同时获得四种淡水鱼各自的特异性标记。     

漠斑牙鲆引进群体子一代遗传多样性的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对引进群体漠斑牙鲆Paralichthys lethostigma 子一代48个个体的遗传多样性进行了分析，筛选的40个10bp的随机引物中，25个引物产生了稳定性好，可重复性强的谱带。共检测到154个位点，其中多态位点有122个，多态位点的比例为79．22％，有效等位基因数为1．5629±0．3631，Nei＇s基因多样性指数为0．3184±0．1843，Shannon信息指数是0．4651±0．2574。结果表明，漠斑牙鲆处于较高的遗传多样性水平。     

中国对虾5个地理群体的RAPD分析

采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对取自辽东湾、渤海湾、海州湾、乳山湾及海洋岛5个群体的中国对虾共95个个体的遗传多样性进行分析。14个随机引物共检测出103个位点(200～2500bp),各群体的多态位点比例在31．07％～34．95％之间。遗传距离显示中国对虾群体间有一定遗传分化,其中辽东湾和乳山湾群体问的遗传距离最大(0．0742),而辽东湾和渤海湾群体间的遗传距离最小(为0．0243),群体间的遗传分化系数为0．2083。整体来看,中国对虾的遗传变异水平较低,遗传多态度为0．1621。用UPGMA对5个群体进行聚类分析,构建谱系关系图。     

RAPD and microsatellite analysis of diploid gynogens from allotetraploid hybrids of red crucian carp (Carassius auratus)×common carp (Cyprinus carpio)

Genetic variation was comparatively analyzed between the artificially induced diploid gynogen population from F₁₀ allotetraploid hybrids of red crucian carp (♀) (Carassius auratus red var., 2n=100)×common carp (♂) (Cyprinus carpio L., 2n=100) and the normal F₁₀ allotetraploid hybrid population used as the control, using random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and microsatellite analysis. The specific 600-bp fragment for diploid gynogen population was detected by S45 and the specific 900-bp fragment for allotetraploid F₁₀ hybrid population was detected by S134. The results from RAPD assay and microsatellite analysis were in agreement with each other, that is to say, the diploid gynogens presented lower level of polymorphism than allotetraploid F₁₀ hybrids. Furthermore, as expected, microsatellite analysis revealed more detailed information on genetic diversity than RAPD assay. The mean percentage of polymorphic loci (12.71%) and Shannon's index of phenotypic diversity (0.25) from RAPD data for diploid gynogen population were significantly lower than those (30.69% and 0.63, respectively) for F₁₀ allotetraploid hybrid population. The mean number of alleles per microsatellite locus (1.73) in diploid gynogen population was considerably lower than that (2.55) in F₁₀ allotetraploid hybrid population. The average observed (0.36) and expected heterozygosity (0.26) in diploid gynogen population were lower than those (0.58 and 0.40, respectively) in F₁₀ allotetraploid hybrid population, indicating that the diploid gynogens presented lower genetic diversity than the allotetraploids. In addition, the mean effective number of alleles at 11 microsatellite loci (1.60) in diploid gynogen population was lower than that (1.88) in F₁₀ allotetraploid hybrid population. The significant differences between two populations in the average observed and expected heterozygosity, mean number of alleles and effective number of alleles, suggested that the effect of gynogenesis resulted in rather higher genetic homogeneity in diploid gynogens. The comparative RAPD analysis of diploid gynogens and their parents was performed with 34 primers. The identical RAPD pattern was detected between diploid gynogens and their female parent, however, some clear specific RAPD bands were detected between diploid gynogens and their male parents, but not detected in their female parent. The result indicated that heterologous genetic material had incorporated into diploid gynogenetic fish (G₁).