河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)Mn-SOD基因的克隆及表达分析

本研究采用c DNA末端快速扩增(RACE)和实时荧光定量PCR等技术,对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)的Mn-SOD基因进行了克隆和表达模式分析。结果显示,克隆得到的河川沙塘鳢Mn-SOD基因的c DNA序列全长为1008 bp,包括678 bp的开放阅读框(ORF),15 bp的5'UTR区和315 bp的3'UTR区,并且具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和31 bp的Poly A尾巴,推测该序列共编码225个氨基酸。该基因包含Sod_Fe_N(28-109)与Sod_Fe_C(116-219)2个保守的结构域,此结构与其他物种极为相似,表明该基因在物种进化中比较保守。与已知物种Mn-SOD进行同源性比对发现,河川沙塘鳢Mn-SOD氨基酸序列与条石鲷(Oplegnathus fasciatus)和线鳢(Channa striata)相似性最高,均为90.3%。采用q RT-PCR技术检测了Mn-SOD基因在河川沙塘鳢8个组织(肾、肝、肌肉、脑、脾、鳃、眼、心脏)和8个发育时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1 d、出膜后3 d)的表达情况。在检测的8个组织中都有Mn-SOD基因的表达,肌肉中的表达量最高;胚胎到仔鱼的8个发育时期都有Mn-SOD基因的表达,桑椹胚期表达量最高。在急性NaNO_2胁迫处理后,河川沙塘鳢肝组织Mn-SOD基因的m RNA表达呈先升高后降低的趋势。而鳃组织Mn-SOD基因的m RNA表达呈先降低后升高再降低的趋势。研究表明,Mn-SOD很可能在对抗NaNO_2胁迫引起的氧化损伤中起重要作用,这将为控制河川沙塘鳢的人工育苗及养殖条件提供有价值的参考资料。     

河川沙塘鳢DMRT1基因的克隆及其表达分析

以河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为研究对象,采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术对DMRT1的全长基因进行了克隆,并利用生物信息学技术分析其结构和功能;采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术检测了河川沙塘鳢DMRT1基因在8种组织(鳃、肠、心、肌肉、脑、肝、脾、性腺)、胚胎发育的8个时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1 d和出膜后3 d)以及性腺发育的4个时期(Ⅰ~Ⅳ期)中的表达变化。结果表明,河川沙塘鳢DMRT1基因c DNA序列的全长为2025 bp,编码297个氨基酸,其中包括894 bp的开放阅读框(ORF),73 bp的5'非编码区和1058 bp的3'非编码区。与已知物种的氨基酸序列比对后发现,河川沙塘鳢DMRT1的氨基酸序列与军曹鱼(Rachycentron canadum)、欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)的同源性最高。DMRT1基因在河川沙塘鳢的精巢组织大量表达,而在卵巢、肌肉、心以及肝4种组织中表达较少,在其它组织中几乎不表达; DMRT1基因在胚胎发育的各个时期都有表达,在原肠期的表达量最高;此外,DMRT1基因表达量在精巢发育的不同时期呈先下降后上升的趋势,在精子成熟期(Ⅳ期)达到最大值,而在卵巢发育的不同时期表达量较少且表达强度差异不明显,因而推测河川沙塘鳢DMRT1基因与精巢的发生和功能的维持有关。研究结果为解析河川沙塘鳢DMRT1基因的功能及其性别决定机制提供了基础资料,也为开展河川沙塘鳢单性育种奠定了基础。     

河川沙塘鳢GHR和IGF-2基因克隆及mRNA的时序表达

生长激素/胰岛素样生长因子-轴(growth hormone/insulin-like growth-axis,GH/IGF-轴)是调控鱼类生长的主要内分泌轴线。为探讨生长相关基因GHR、IGF-2对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)生长发育的调控机制,采用cDNA末端快速扩增(RACE)和实时荧光定量PCR等技术,对河川沙塘鳢的GHR、IGF-2基因进行了克隆和表达模式分析。研究结果显示:河川沙塘鳢GHR基因的cDNA全长序列为2 179 bp,开放阅读框为1 830 bp,共编码609个氨基酸,IGF-2基因的cDNA全长序列为1 586 bp,开放阅读框642 bp,共编码213个氨基酸。采用qRT-PCR方法检测了GHR、IGF-2基因在9个不同组织(脑、肝、心、肌肉、脾、肠、性腺、鳃、肾)和8个胚胎不同发育时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1 d、出膜后3 d)的表达情况。结果表明:IGF-2和GHR基因在所检测的9种组织中均有表达,其中以肝脏、肌肉、性腺、脑中的表达量较高,在胚胎发育阶段GHR和IGF-2基因表达呈先上升后下降的趋势,在原肠胚期表达量较高,表明其在胚胎发育过程中发挥重要作用。qRT-PCR进一步比较了雌、雄河川沙塘鳢GHR和IGF-2基因在不同生长发育阶段(90、150、210、270、330 d)脑、肝、肌肉mRNA的表达量,结果表明:各时期雄鱼GHR和IGF-2基因在肝组织中表达量均显著高于雌鱼,肌肉和脑GHR基因mRNA的表达量则无显著差异。而IGF-2基因则仅在雌、雄鱼210 d的脑和150、210 d的肌肉存在显著性差异,推测肝GHR和IGF-2基因mRNA表达的雌雄差异是河川沙塘鳢雌雄生长差异的主要原因之一。     

基于线粒体D-loop基因序列研究我国5种虾虎鱼类的系统进化关系

利用PCR技术扩增河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)、鸭绿沙塘鳢(Odontobutis yaluensis)、中华沙塘鳢(Odontobutis sinensis)、葛氏鲈塘鳢(Perccottus glenii)及尖头塘鳢(Eleotris oxycephala)的线粒体D-loop区并测序,获得河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢、中华沙塘鳢、葛氏鲈塘鳢及尖头塘鳢线粒体D-loop区全序列分别为853bp、853bp、1028bp、852bp、848bp,结合GenBank中平头沙塘鳢(Odontobutis platycephala)、刺盖塘鳢(Eleotris acanthopoma)、黑体塘鳢(Eleotris melanosoma)、褐塘鳢(Eleotris fusca)、中华乌塘鳢(Bostrychussinensis)、云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)、溪鳢(Rhyacichthys aspro))等7种虾虎鱼类同源的D-loop区序列,分析了这12种虾虎鱼类的系统发育关系。所使用的同源序列长度为832～846bp,其中保守位点452个,变异位点405个,简约信息位点258个,单态位点145个,转换/颠换平均值为0.8。基于Kimura2-parameter模型的12种虾虎鱼类遗传距离范围为0.043～0.312,在Kimura2-parameter模型构建的邻接树和非加权配对法系统树中,河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢、中华沙塘鳢、平头沙塘鳢聚为一大支,刺盖塘鳢、黑体塘鳢、褐塘鳢、尖头塘鳢、溪鳢、葛氏鲈塘鳢聚为另一支。     

河川沙塘鳢线粒体基因组重排机制及分子标记筛选

采用引物步移法PCR扩增,获得全长为16846 bp的河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)线粒体全基因组DNA(mt DNA),并对其基因结构、重排机制及在系统发育中的应用进行了分析。研究结果:(1)河川沙塘鳢mt DNA由37个基因和1个非编码控制区组成;除ND6和8个t RNA外,其他基因都编码在重链(H)上;t RNA基因因发生滑移重排(shuffling),将经典的线粒体基因组HSL(t RNAHis–t RNASer–t RNALeu)排列变成了SLH(t RNASer–t RNALeu–t RNAHis)排列,造成在t RNALeu与t RNAHis、ND4与t RNASer之间分别插入了320 bp和42 bp的两个"匿名区"。(2)检测的112种鲈形目(Perciformes)鱼类中,仅有13种(11.61%)发生了mt DNA基因重排现象,而沙塘鳢属的中华沙塘鳢(O.sinensis)、平头沙塘鳢(O.platycephala)与河川沙塘鳢的基因重排位置一致,揭示其可能是沙塘鳢属鱼类进化过程中的一个重要分子"标签"。(3)筛选得到的两个分子标记ND4和ND5基因,适合用于虾虎鱼亚目(Gobioidei)鱼类科阶元水平的系统发育关系的重建。     

河川沙塘鳢胚胎发育的研究

对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila Günther)的胚胎发育进行研究.结果显示:河川沙塘鳢胚胎发育可分成受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、体节分化、腮和出膜等8个阶段.根据每个阶段的形态建成和发育特点,卵裂阶段被细分为2～32细胞期和桑葚期,囊胚阶段分为囊胚早期、中期和晚期,原肠阶段分为原...     

湖州河川沙塘鳢群体线粒体DNA cyt b基因序列的遗传多样性分析

河川沙塘鳢具有肉鲜味美，细嫩可口的特点，营养价值与经济价值颇高，是一种极具发展潜力的水产养殖品种，对野生和人工繁育河川沙塘鳢的遗传结构进行检测分析，可为选育和种质保护提供参考资料。本文对湖州河川沙塘鳢(钟管野生群体及八里店养殖群体)的线粒体细胞色素b(cyt b)基因全长进行扩增和测序，并应用生物信息学软件与Gen Bank中太湖、鄱阳湖和巢湖3个群体的数据进行比较。河川沙塘鳢cyt b基因全长1141 bp,4种碱基在所得序列中平均含量为A(26.8%)、G(13.8%)、T(28.0%)、C(31.4%)，序列分析显示，cyt b基因序列中变异位点378个，占分析位点的44.26%，含有241个简约信息位点，平均转颠换比值(TS/TV)为0.76。在5个群体138个个体中共检测到75个单倍型，平均单倍型多样性为0.869～1.000，核苷酸多样性为0.01431～0.03848。各群体间遗传距离差异较大(0.01493～0.05868)，其中八里店与钟管群体的遗传距离最小(0.01493)，而鄱阳湖与巢湖群体的遗传距离最大(0.05868)，与构建的聚类图分析结果一致。群体中性检验...     

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示：引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD₅₀为1.8×10⁶ CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃...     

河川沙塘鳢(♀)与云斑尖塘鳢(♂)杂交子代胚胎发育研究

以河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为母本、云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)为父本进行科间人工远缘杂交,对杂交子代胚胎发育情况进行了观察和记录,描述了各个发育阶段的形态特征。结果显示:杂交子代的胚胎发育可分为受精、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、体节、鳃、孵化期8个阶段。根据每个阶段的形态建成以及发育特点,分为31个主要时期,卵裂阶段从2细胞期至32细胞期和桑葚期;囊胚阶段有囊胚早期、囊胚晚期;原肠阶段有原肠早期、原肠中期、原肠晚期;神经胚阶段有神经胚早期、神经胚晚期;体节分化阶段从2体节期到41体节期;鳃阶段又可分为消化系统形成期、肝脏形成期、鳃裂期以及脾脏和口裂形成期;最后的孵化期分为出膜前期、出膜期。在温度为(20±2)℃的孵化条件下,杂交子代的受精卵经501 h孵出仔鱼。     

云斑尖塘鳢微卫星标记在两种虾虎鱼亚目鱼类群体间的适用性研究

利用微卫星DNA-聚合酶链式反应(STR-PCR)技术对已开发的14对云斑尖塘鳢(Oxyeleotrismarmorata)微卫星标记在线纹尖塘鳢(Oxyeleotris lineolatus)和河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)群体间进行通用性分析。结果显示,14对云斑尖塘鳢微卫星标记在线纹尖塘鳢群体均能扩增出特异性条带,在河川沙塘鳢群体中也有10对引物可稳定扩增,其中9对在线纹尖塘鳢群体中具有高度多态性,6对在河川沙塘鳢群体中具有高度多态性。通过这10对通用微卫星标记检测3个种群的平均观测杂合度(Ho)为0.344 9,平均期望杂合度(He)为0.704 3,平均多态信息(PIC)含量为0.536 9。同时获得3个有着较高的通用性微卫星位点(H27、H142和H97),平均PIC值均大于0.5,具有高度多态性,在3种虾虎鱼亚目鱼类中具有较高的通用性,这3个位点在3种虾虎鱼亚目鱼类之间共检测得到6～22个不等的等位基因,并获得1个可以用于鉴别沙塘鳢科与塘鳢科特异基因型的等位基因位点(H97)。因此,通过已开发的云斑尖塘鳢微卫星标记来获得适用相近物种的微卫星标记是可行的。     

尼罗罗非鱼p38MAPK基因克隆与表达分析

为了探究p38MAPK与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫功能的相关性,本实验运用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得尼罗罗非鱼埃及品系ntp38MAPK的cDNA全长序列,结果显示,该序列全长1789 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长1086 bp,5′非编码区(Untranslated Region,UTR)长342 bp,3′UTR为361 bp。ORF编码361个氨基酸,预测分子量为41.598 kD,理论等电点为5.10。序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)双磷酸化位点以及紧密相连的底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)。同源性以及系统进化树分析结果显示,尼罗罗非鱼的p38MAPK与大黄鱼(Larimichthys crocea)和鲈(Dicentrarchus labrax)的相似性最高。采用qRT-PCR的方法研究了ntp38MAPK在各组织以及无乳链球菌感染过程中的表达差异情况,结果显示,ntp38MAPK在各组织均有表达,其中在肌肉的表达量最高,心脏、肝脏、脾脏次之,头肾中的表达量最低。无乳链球菌感染过程中,脾脏、头肾中ntp38MAPK的表达量在2 h开始上调,肝脏中4 h开始上调,8 h后肝脏、脾脏和头肾中的表达量都有所下降,24~72 h趋于平稳,表明ntp38MAPK在尼罗罗非鱼抵抗链球菌侵染过程中发挥重要作用。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

海蜇(Rhopilema esculentum)Notch基因的cDNA克隆和表达

基于转录组454 GS FLX测序结果,利用RACE和RT-PCR技术克隆了海蜇(Rhopilema esculentum) Notch基因的cDNA全长,并分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达差异,以探讨Notch基因对海蜇无性生殖的影响.结果显示,海蜇Notch基因的cDNA全长为6768 bp,包括90 bp的5'非编码区、6066 bp的开放阅读框及612 bp包含AATAAA加尾信号的3'非翻译区.SMART分析表明,海蜇Notch为分泌蛋白,其信号肽由21个氨基酸组成.成熟肽由2000个氨基酸组成,包括37个结构域、26个表皮生长因子样结构域、3个富含半胱氨酸的Notch/Lin-12(NL)结构域、1个NOD结构域、1个NODP结构域、1个跨膜结构域和6个锚蛋白结构域ANK,并含有25个N-糖基化位点.同源分析表明,海蜇Notch与来自刺胞动物门的海葵(Nematostella vectensis)的Notch相似性为39％,与无脊椎动物和脊椎动物的氨基酸相似度分别为35％-37％和34％-38％.RT-PCR分析表明,Notch基因在海蜇无性繁殖的4个发育时期均有表达,螅状体阶段的表达量最高,横裂体阶段表达量最低,螅状体的表达量是横裂体的1.85倍.这些研究结果为进一步研究Notch信号通路在海蜇无性繁殖中的调控作用奠定了基础.     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

缢蛏IGFBP基因结构及生长性状相关SNP筛选

类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)是IGF系统的一部分,主要参与IGF的运输、定位和生物活性调节。本研究采用RACE技术和长PCR技术,克隆了缢蛏IGFBP基因的cDNA和DNA全长序列,应用荧光定量PCR技术分析了缢蛏不同发育时期和不同组织中IGFBP mRNA的表达特征,并进一步筛选了IGFBP基因与生长性状相关的SNP位点。序列分析表明,缢蛏IGFBP cDNA序列全长631 bp,包括5'端非编码区60 bp,3'端非编码区136 bp和开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸。该基因含有保守的IGFBP-N端,包含12个半胱氨酸残基,其中1～18个氨基酸为信号肽,属于分泌型蛋白。IGFBP DNA全长3 122 bp,其中包含1个内含子(2 687 bp)和2个外显子(200和235 bp)。荧光定量PCR结果显示,IGFBP mRNA在消化腺组织中表达量最高;在缢蛏的稚贝期,IGFBP mRNA呈现高表达,而在其他发育时期表达量低。在IGFBP基因中筛选到4个SNP位点,其中1个SNP位点与缢蛏的壳长和体质量呈显著相关。     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析.结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 kDa和8.55.GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成.序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同.半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41％-90.5 9％),其次为鲽形目、鲑形目和鲍形目(78.82％-85.88％),与鲤形目同源性最低(61.18％-71.76％).gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低.此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期).在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加.然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降.上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程.     

缢蛏2-CRD型半乳糖凝集素(Galectin)基因的克隆和表达分析

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1 282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF) 918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集素含1个糖识别结构域(CRD)不同,ScGL具有2个CRD。相似性分析显示,ScGL与其他软体动物的半乳糖凝集素具有较高的相似性,与菲律宾蛤仔相似性最高,达65%;与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性分别为39.74%和44.76%。系统进化上ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达,分子量约34.4 ku。荧光定量PCR分析显示,ScGL在缢蛏鳃、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和内脏团中均表达;其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高,出水管和入水管中表达量最低。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌感染后3 h和48 h显著高于对照组;鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6 h和48 h显著高于对照组,说明ScGL参与了病原体诱导的缢蛏免疫应答。本研究为深入探索ScGL在缢蛏免疫中的作用奠定基础。