半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析。结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长c DNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 k Da和8.55。GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成。序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同。半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41%–90.59%),其次为鲽形目、鲑形目和鲀形目(78.82%–85.88%),与鲤形目同源性最低(61.18%–71.76%)。gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低。此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期)。在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加。然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降。上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程。     

半滑舌鳎促性腺激素α亚基cDNA的克隆及组织表达特征

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,从半滑舌鳎脑垂体中克隆了促性腺激素α亚基（CGα）全长cDNA（GenBank序列登录号：JQ364953）.半滑舌鳎CGα基因全长685bp,其开放阅读框384bp,编码含127个氨基酸的蛋白,N端33个氨基酸为信号肽.半滑舌鳎CGα成熟肽与其他脊椎动物CGα成熟肽结构特征相似,具有10个半胱氨酸残基和两个N-糖基化位点.CGα成熟肽序列分析表明,半滑舌鳎CGα与鲽形目和鲈形目鱼类CGα同源性为60％～70％,与鲤形目鱼类CGα同源性为55％～60％.实时荧光定量RT-PCR结果表明,半滑舌鳎CGα mRNA在被检测的12个组织中均有表达,除头肾和脾脏、脾脏和肝脏间表达量差异不显著外,其他组织间表达量差异显著（P＜0.05）;CGα mRNA在垂体组织中大量表达,其次是鳃、肾脏、肌肉、卵巢和脑组织,而在心脏、头肾、肝和脾等组织中表达量很低.本研究为进一步探讨促性腺激素在半滑舌鳎繁殖生理中的作用机制奠定基础.     

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。     

GH/IGF-Ⅰ轴对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育的调控作用

为深入认识半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生殖调控机制,研究了生长轴(GH/IGF-Ⅰ axis)对半滑舌鳎卵巢发育调控的作用及可能机制;分析了卵巢不同发育时期垂体中的生长激素(GH),脑、性腺和肝脏中的类胰岛素生长因子Ⅰ (IGF-Ⅰ)mRNA的表达水平变化;检测了卵巢不同发育期,血清GH、IGF-Ⅰ、雌二醇(E2)、睾酮(T)的表达水平变化,并分析了生长因子与性腺指数(GSI)、E2和T表达变化的关系.结果显示,垂体GH mRNA表达水平在Ⅳ期卵巢时显著升高,至Ⅴ期时达峰值,随后(Ⅵ期)显著降低,垂体GH mRNA表达水平与GSI、血清GH与IGF-Ⅰ表达水平呈显著正相关.血清GH与垂体GHmRNA表达水平表现出相似的变化趋势.肝脏IGF-ⅠmRNA表达水平在Ⅳ期和Ⅴ期卵巢时较低,但Ⅵ期时又显著升高,其与脑IGF-Ⅰ mRNA及血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著正相关,而与血清E2和T表达水平呈显著负相关.脑IGF-Ⅰ mRNA表达水平自Ⅱ期卵巢开始显著升高,至Ⅳ期时达峰值,并与血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著负相关.卵巢IGF-ⅠmRNA表达水平自Ⅱ期开始显著升高,并在Ⅳ期时达峰值,但在Ⅴ期时明显下降,并保持至Ⅵ期,与血清E2表达水平呈显著正相关,而与血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著负相关.血清IGF-Ⅰ变化趋势与肝脏IGF-ⅠmRNA相似.结果揭示了GH、IGF-Ⅰ在转录和血清水平上以协同或者拮抗的方式共同参与了半滑舌鳎卵巢发育的过程,其作用途径可能与性类固醇激素的合成与分泌有关,表明GH/IGF-Ⅰ轴对卵巢发育具有重要的调控作用,为深入认识半滑舌鳎卵巢发育的调控机制提供了新的思路和素材.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)黑色素聚集素受体(MCHR)表达特性及其与无眼侧黑化的关系

利用cDNA末端快速克隆技术(RACE)获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)2种黑色素聚集素受体(MCHR1和MCHR2)的cDNA全长序列,并采用定量PCR技术分析了MCHR mRNA的组织表达特性,研究了其与无眼侧黑化程度的关系.结果显示,半滑舌鳎MCHR1 cDNA序列全长为1685 bp,开放阅读框(ORF)长为1080 bp,编码359个氨基酸,与牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性高达83.3％.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR1与鲋形目、鲽形目和鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR2 cDNA序列全长为1626bp,ORF长为1044bp,编码347个氨基酸,与鲽形目同源性最高达到90％以上.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR2与鲽形目、鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR1 mRNA在鳃中表达量最高,而MCHR2 mRNA在有眼侧皮肤中表达量最高,性腺次之.另外,MCHR1和MCHR2 mRNA在其他组织中均检测到表达,这表明半滑舌鳎黑色素聚集素(MCH)可能通过内分泌方式和各组织中的MCHR介导参与生理调控.不同黑化面积表达分析显示,在无眼侧黑化发生早期,脑垂体中MCHR1 mRNA显著升高,在无眼侧50％黑化组达到峰值,皮肤中MCHR1 mRNA在无眼侧10％黑化组显著升高,其后保持较高水平;脑垂体和皮肤中MCHR2mRNA表达表现出一致的变化趋势,在无眼侧黑化发生早期都达到峰值,其后逐渐下降至相对较低水平.表明MCHR可能直接或通过其他信号通路参与了半滑舌鳎无眼侧黑化性状的调控过程.     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1 (PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P＜0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1mRNA表达量最高(P＜0.05).采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过qRT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测.结果显示,20IU/mlHCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系.HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P＜0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用.PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料.     

GH/IGF-Ⅰ轴对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育的调控作用

为深入认识半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生殖调控机制,研究了生长轴(GH/IGF-Ⅰaxis)对半滑舌鳎卵巢发育调控的作用及可能机制;分析了卵巢不同发育时期垂体中的生长激素(GH),脑、性腺和肝脏中的类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的表达水平变化;检测了卵巢不同发育期,血清GH、IGF-Ⅰ、雌二醇(E2)、睾酮(T)的表达水平变化,并分析了生长因子与性腺指数(GSI)、E2和T表达变化的关系。结果显示,垂体GH mRNA表达水平在Ⅳ期卵巢时显著升高,至Ⅴ期时达峰值,随后(Ⅵ期)显著降低,垂体GH mRNA表达水平与GSI、血清GH与IGF-Ⅰ表达水平呈显著正相关。血清GH与垂体GH mRNA表达水平表现出相似的变化趋势。肝脏IGF-ⅠmRNA表达水平在Ⅳ期和Ⅴ期卵巢时较低,但Ⅵ期时又显著升高,其与脑IGF-ⅠmRNA及血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著正相关,而与血清E2和T表达水平呈显著负相关。脑IGF-ⅠmRNA表达水平自Ⅱ期卵巢开始显著升高,至Ⅳ期时达峰值,并与血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著负相关。卵巢IGF-ⅠmRNA表达水平自Ⅱ期开始显著升高,并在Ⅳ期时达峰值,但在Ⅴ期时明显下降,并保持至Ⅵ期,与血清E2表达水平呈显著正相关,而与血清IGF-Ⅰ表达水平呈显著负相关。血清IGF-Ⅰ变化趋势与肝脏IGF-ⅠmRNA相似。结果揭示了GH、IGF-Ⅰ在转录和血清水平上以协同或者拮抗的方式共同参与了半滑舌鳎卵巢发育的过程,其作用途径可能与性类固醇激素的合成与分泌有关,表明GH/IGF-Ⅰ轴对卵巢发育具有重要的调控作用,为深入认识半滑舌鳎卵巢发育的调控机制提供了新的思路和素材。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp，开放阅读框为393bp，编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明，半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％，与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树，获得的进化树表明，半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类，亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明，FSHmRNA除在垂体中大量表达外，其他组织也有表达，尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达，暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)新型膜孕激素受体基因(mPRL)在卵母细胞成熟过程中的表达特征

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)人工育苗技术的水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(mPR-like,mPRL)基因的表达特征和作用机制进行了研究.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现半滑舌鳎mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织的细胞学定位,发现mPRL mRNA分布在半滑舌鳎性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑的神经元和垂体内分散的细胞中,mPRL mRNA阳性信号较强.制备半滑舌鳎mPRL的多克隆抗体,采用Westem blotting方法检测半滑舌鳎mPRL蛋白在不同组织的表达特征,发现mPRL蛋白的表达量在卵巢、脑、垂体中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,半滑舌鳎mPRL蛋白在卵巢、脑和垂体的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.应用实时定量PCR和Westem blotting方法检测促性腺激素调控下半滑舌鳎不同时相卵母细胞mPRL基因mRNA和蛋白的表达变化,结果显示,促性腺激素对半滑舌鳎卵母细胞中mPRL基因mRNA和蛋白表达都有一定的上调作用,特别是对Ⅴ时相卵母细胞中mPRL mRNA和蛋白的表达量提升明显;发现表达量与促性腺激素调控作用具有剂量依存关系.半滑舌鳎mPRL在繁殖相关组织的表达特征表明其通过脑-垂体-卵巢轴参与繁殖调控,同时也揭示了mPRL介导卵母细胞成熟机制.     

GnIH多肽对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)下丘脑生殖相关基因表达的影响

本研究首次通过下丘脑离体孵育的方法研究促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)多肽对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)下丘脑中生殖相关基因的表达调控.研究结果显示,tsGnIH-1促进了gnrh2和gnih的表达,对gnrh3和kiss2的表达无影响;tsGnIH-2抑制了gnrh3的表达,对gnrh2、kiss2和gnih的表达无影响.GnIH多肽对生殖相关基因的不同调控表明同一前体蛋白编码的不同GnIH多肽在生殖调控中的作用不尽相同.本研究结果增加了对GnIH参与鱼类生殖调控机制的认识,为深入研究奠定了基础.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

mRNA expression of GnRH variants and receptors in the brain,pituitary and ovaries of pejerrey (<Emphasis Type="Italic">Odontesthes bonariensis</Emphasis>) in relation to the reproductive status

The present study examined the differential mRNA expression levels of three forms of GnRH (sGnRH, pjGnRH and cGnRH-II) and two forms of GnRH receptor (pjGnRH-R I and pjGnRH-R II) in the brain, pituitary, and ovaries of pejerrey in relation to the reproductive status. The analysis revealed the presence of significant amounts of mRNA of the three GnRH forms while the ovaries showed only two (sGnRH and pjGnRH). The GnRH receptor II was found ubiquitously in the brain, pituitary, and ovaries while the form I was detected only in the brain. The levels of pjGnRH mRNA in the brain and pjGnRH-R II in the pituitary gland varied in correlation with the ovarian condition. However, brain sGnRH and pjGnRH-R I mRNA levels reached a maximum during early stages of ovarian development. In contrast, the brain levels of cGnRH-II mRNA showed no variation. The present study also shows a good correlation of ovarian sGnRH and pjGnRH-R II mRNA levels with the reproductive condition, suggesting that these molecules are may be involved in the regulation of pejerrey ovarian function.     

Insights into kisspeptin- and leptin-signalling on GnRH mRNA expression in hypothalamic organ cultures of immature pikeperch <Emphasis Type="Italic">Sander lucioperca</Emphasis>

Two types of gonadotropin-releasing hormones (GnRH) were identified as gnrh1 and gnrh2 in pikeperch Sander lucioperca. The administration of rodent leptin on hypothalamic organ cultures of immature pikeperch resulted in significantly elevated levels of gnrh2, but not in gnrh1 mRNA, whereas kisspeptin-10 administration did not affect gnrh1 or gnrh2 expression. These results represent preliminary insights into leptin-GnRH-signaling on a hypothalamic level in fish, potentially coupling fat metabolism and the activation of the reproductive axis during puberty. Mammalian leptin and kisspeptin-10, however, failed to initiate a consistent response in pikeperch and their use cannot be recommended.     

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LH β基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。