6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

嗜水气单胞菌QseC在响应去甲肾上腺素中的作用

QseBC是一种普遍存在于细菌的双组分调控系统(two-component regulatory system,TCS),能感应细胞外环境因子信号,在调控细菌毒力中发挥着重要作用。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)QseC在识别和响应宿主应激激素去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)及其对毒力因子表达的调控作用,本实验首先构建了嗜水气单胞菌NJ-35缺失突变株ΔqseC与互补株qseC+,分析了在NE诱导下野生株和突变株的体外毒力因子表达和鱼体死亡率的变化。结果表明,qseC的缺失抑制了NE对嗜水气单胞菌的促生长作用,降低了NE对生物膜形成能力和溶血活性的增强作用及其对罗非鱼的致死率,而对运动性、脂肪酶与蛋白酶活性没有产生显著影响。本实验明确了嗜水气单胞菌QseC能够响应NE,从而调节菌株的毒力,对全面认识嗜水气单胞菌的致病机理及其与宿主的互作机制有着重要意义,并为探索疾病防控新技术奠定相关理论基础。     

秦皮素的抑菌作用及其对嗜水气单胞菌毒力的影响

为探讨中草药单体秦皮素对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长和毒力的影响,实验测定了秦皮素对嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)、生长曲线、生物膜以及脂肪酶活性、运动性、蛋白酶活性和溶血性等毒力相关因子的影响。结果表明,秦皮素对嗜水气单胞菌具有明显的抑制效果, MIC为128μg/mL;秦皮素浓度大于16μg/mL时,对嗜水气单胞菌的生物膜形成有显著促进作用(P0.05);秦皮素浓度大于8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的脂肪酶活性有显著降低作用(P0.05);秦皮素浓度为2～8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的运动性和溶血性无显著影响(P 0.05),但能降低嗜水气单胞菌蛋白酶活性(P0.05)。秦皮素对嗜水气单胞菌有一定的抑菌作用,但期望通过低浓度秦皮素实现对嗜水气单胞菌的防治仍有待进一步研究。     

嗜水气单胞菌毒力因子研究进展

嗜水气单胞菌是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌,是一种人一兽一鱼共患病的条件致病菌。其危害的产生与其外毒素、胞外蛋白酶及表面分子等毒力因子的分泌、表达相关。研究其毒力因子有利于深入了解该菌的致病机理,探索有效的防治方法。本文综述了嗜水气单胞菌毒力因子的相关研究进展。     

嗜水气单胞菌UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶的性质

通过水生动物源性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段，该片段与创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因，进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a（＋），在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中进行异源表达，SDS-PAGE结果显示，重组表达蛋白的分子量约59．7kD，与理论推测值基本相同。酶活性分析表明，该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺，确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western Blot分析显示，嗜水气单胞菌J-1株胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白，表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性。以重组蛋白为免疫原，对小鼠进行动物保护实验，结果显示，该重组蛋白对小鼠有60％的保护率，证明UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶可作为亚单位疫苗的侯选成分。     

嗜水气单胞菌研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属,是嗜温、有动力的气单胞菌群,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性,是一种典型人—兽—鱼共患病病原[1],可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻,往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失,已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。目前国内外学者对嗜水气单胞菌的研究已有了很大进展。本文将国内外有关嗜水气单胞菌研究现状从其毒力因子以及诊断与检测技术方面综述如下。1　毒力因子嗜水气单胞菌可产生各种毒力因子,包括…     

草鱼miR-23a在嗜水气单胞菌感染过程中的调控机制

为探索嗜水气单胞菌感染后草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)中miR-23a的调控机制,实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定了嗜水气单胞菌感染CIK细胞后miR-23a的表达量变化,使用RNAhybrid软件预测miR-23a的靶基因并用双萤光素酶报告基因检测系统进...     

高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究

为评价斑马鱼口服高丝氨酸内脂酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒的保护效应,实验设置基础料与实验料两组饲料,实验料是在基础料中按3 U/g饲料添加N酰基高丝氨酸内酯酶AI-96(以下简称AI-96),通过高浓度(2.5×108 cfu/mL)及低浓度(0.7×108 cfu/mL)两组剂量的嗜水气单胞菌NJ-1(以下简称NJ-1)分别浸浴攻毒斑马鱼,在12h、24 h、3d、7d和14d取鳃丝、肠道壁、肝和肾样,采用实时荧光定量PCR法检测取样器官中NJ-1量,并统计攻毒周期内的死亡率,来评价高丝氨酸内酯酶AI-96的保护力.结果显示:在攻毒周期内所取组织内均检测到NJ-1,按菌数肠＞鳃＞肝＞肾,其中高NJ-1剂量未加酶组各组织NJ-1数量均分别明显高于低剂量处理组.在高剂量攻毒条件下,加酶组各组织NJ-1数量均显著低于未加酶处理组(P＜0.05),鳃除外;在低剂量攻毒条件下,未加酶组的NJ-1数量在鳃(3 d)、肠(0.5、1、3、7及14 d)、肝(3 d)和肾(7 d)显著高于加酶组(P＜0.05),其余差异不显著(P＞0.05).此外无论在高、低剂量攻毒条件下,加酶组的死亡率均低于未加酶组,其中低剂量攻毒7d及以后其死亡率显著低于对照(P＜0.05).结果表明,口服AI-96可以有效预防NJ-1≤0.7×108 cfu/mL范围内的侵袭.     

鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白双向电泳与质谱鉴定

为建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱并进行质谱分析,利用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术对嗜水气单胞菌的蛋白质组学进行鉴定研究。结果显示,嗜水气单胞菌28°C培养12 h、三氯醋酸(TCA)/丙酮沉淀法提取全菌蛋白、等电聚焦20 000 Vh的2-DE图谱匹配率达81%;采用18 cm、p H 3-10 IPG胶条进行2-DE分析获得146个蛋白点,随机选取部分蛋白点进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,共鉴定23个蛋白点包括膜脂蛋白、分子伴侣、30S核糖体蛋白S1、延伸因子、细胞色素C等,其中发现烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、精氨酸脱亚氨酶、ATP合酶α亚基、脱氧核糖核酸聚合酶亚基α、氨基甲酸激酶、腺苷酸激酶、尿苷磷酸化酶、硝基还原酶、肽酰脯氨酰异构酶共计11个代谢相关蛋白酶;基于分子功能进行蛋白分类(GO)分析,发现主要为结合(17.1%)、催化(14.3%)和转移酶(11.4%)等生物学过程。建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱与部分蛋白鉴定,有助于理解嗜水气单胞菌的蛋白质组学及其分子机制。     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾[鱼回](Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定性肠毒素、丝氨酸蛋白酶和溶血素等7种毒力基因。分离株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4在15~17℃水温下腹腔注射攻毒的半数致死浓度(LD 50)依次为0.49×10^4、0.78×10^4、0.53×10^4、3.84×10^4 CFU/g;而在23~26℃水温下测得的LD 50依次为1.48×10^4、1.80×10^4、0.82×10^4、0.68×10^4 CFU/g。分离株混合感染比单一株感染均表现出更强的致死能力。分离菌株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考均敏感,但因患病鱼不能摄食药饵而导致治疗失败。     

中华绒螯蟹卵巢EJ01基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

扩增中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢EJ01（GenBank检索号：AYl85917）的cDNA全序列得到编码区序列，并将其插入原核表达载体pET28b中，构建成表达质粒pET28b-EJ01。该表达质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，得到EJ01-HIS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明，该融合蛋白的相对分子质量约为32000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJ01-HIS6融合蛋白。     

中华绒螯蟹卵巢EJO1基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

扩增中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢EJO1基因(GenBank检索号:AY185917)的cDNA全序列得到编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28b中,构建成表达质粒pET28b-EJO1。该表达质粒在大肠杆菌(Esche-richia coli)BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到EJO1-H IS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该融合蛋白的相对分子质量约为32 000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJO1-H IS6融合蛋白。     

海带配子体γ-碳酸酐酶的基因克隆与功能鉴定

本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)等技术获得海带配子体细胞一个γ-亚型碳酸酐酶(CA)基因的cDNA及DNA全长序列。其cDNA长为1618 bp,编码由305个氨基酸组成的蛋白;DNA长为11812 bp,具6个内含子,将开放阅读框(ORF)分割成7个外显子;其具有一个gamma-CA的结构域,并具有一个独特的左手平行β-螺旋结构域;由36个CA的氨基酸序列所构建的聚类图显示,该CA与其他物种的γ-CA聚为一支。因而,将该克隆的基因命名为Sjγ-CA。为了解其编码蛋白的功能,将Sjγ-CA的ORF亚克隆至表达载体pET28a上,导入大肠杆菌表达菌株BL21中,培养并诱导目的基因表达,亲和层析以纯化重组蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)、免疫印迹和质谱技术鉴定结果表明,纯化所获得的重组蛋白是Sjγ-CA。利用电极法和分光光度计法分别检测重组的Sjγ-CA在CO2与示,重组Sjγ-CA的水合酶比活力为0.82 U/mg,但没有酯酶活性,从而从功能上鉴定了Sjγ-CA。该研究为后续探讨Sjγ-CA在海带配子体乃至孢子体细胞或组织中的亚细胞定位等研究奠定了基础。     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

河南华溪蟹生殖调控分子VASA的原核表达、抗体制备及免疫鉴定

为了研究生殖调控分子VASA在河南华溪蟹性腺发育过程中的表达模式和功能,本研究制备了VASA蛋白特异的多克隆抗体。选取河南华溪蟹vasa基因813 bp的特异区段,克隆到p ET32a载体,构建了原核表达载体p ET32a-Shvasa,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测。结果显示,47 ku的VASA融合蛋白在菌液上清液中大量存在。VASA融合蛋白经Ni-NTA His-Bind亲和层析柱分离纯化后,免疫新西兰大白兔,制备了河南华溪蟹VASA蛋白的多克隆抗体。ELISA检测显示,VASA蛋白多克隆抗体的效价高达1.0×105。进一步通过免疫吸附实验和Western blot方法鉴定抗体特异性,研究表明,获得的多克隆抗体不仅能识别VASA融合蛋白,而且能特异识别河南华溪蟹卵巢中的天然VASA蛋白。研究为鉴定河南华溪蟹及其他蟹类生殖细胞提供了有效手段,为进一步解析十足目动物VASA蛋白的功能提供了分子基础。     

抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果.用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度.成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合.该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础.     

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明,表达的VP3蛋白与天然的IPNVVP3蛋白一样具有相同的抗原性。试验利用原核表达系统成功地高效表达了IPNVVP3蛋白,融合蛋白以可溶性形式存在,并制备了高效价的抗血清。     

刺参甘露糖结合凝集素的原核表达、纯化及生物活性分析

为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni²⁺离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集最小浓度为10 μg/mL。本实验成功构建了AJ-MBL原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了17 ku AJ-MBL蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性。     

传染性胰腺坏死病毒VP3基因的分段表达及其抗原表位区域分析

采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV) VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1 -VP3(L1)、pET32a-VP3( L2)、pGEX-6P1-VP3( L3)和pGE...     

Development of immunodot blot assay for the detection of white spot syndrome virus infection in shrimps (Penaeus monodon)

The VP 28 gene encoding a structural envelope protein of the white spot syndrome virus (WSSV) was cloned into a pET32a(+) expression vector for the production of the recombinant VP28 protein. A purified recombinant protein of 39.9 kDa size was used for polyclonal antibody production in rabbit. Specific immunoreactivity of the rabbit anti rVP28 antiserum to the viral antigen was confirmed by a Western blot. The specificity of this polyclonal anti‐rVP28 antiserum to detect the presence of the virus in WSSV‐infected Penaeus monodon was verified using a immunodot blot assay. Immunodot blot showed a positive reaction in infected shrimp tissues with prominent colour development using 3,3′,5,5′‐tetramethylbenzidine (TMB) as a chromogenic substrate when compared with 3–3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Highest signal intensities of the immunodots were observed in infected shrimp pleopod extracts and haemolymph. On comparison with polymerase chain reaction (PCR), immunodot blot could detect 76% of PCR‐positive WSSV‐infected shrimp samples. Immunodot blot was found to be equivalent to first‐step PCR sensitivity to detect WSSV particles estimated to contain 1.0 × 10⁵ viral DNA copies.