魁蚶核糖体DNA基因转录间隔区的序列特征

以相应引物PCR扩增魁蚶(Scapharca broughtonii)的核糖体转录间隔子ITS-1和ITS-2片段,测序后得到长度分别为461bp和533bp的核苷酸序列(含引物)。其中A、T、G、C4种碱基的含量分别为21．91％、24．73％、28．20％和25．16％(ITS-1),27．02％、25．52％、25．52％和21．95％(ITS-2)。将这2个片段与其他双壳贝类的相应片段进行比较,发现11S1和11S2引物在贝类中具有良好的通用性。比较几种贝类的11S1片段发现有1～100bp长度不等、弥散状态的插入／缺失;对5种蚶科贝类的ITS-2相应片段进行比较,发现中间有75bp的保守区域,与本研究在魁蚶ITS-2群体序列研究中观察到的情况相同。     

福建缢蛏野生群体与养殖群体的ITS-1和ITS-2分析

采用PCR技术对福建缢蛏的霞浦野生群体(WP)和漳湾养殖群体(CZ)进行了ITS-1和ITS-2的多态性分析。利用贝类通用引物扩增了ITS-1和ITS-2序列,PCR产物经纯化、测序、同源序列比对,获得长度分别为495 bp的ITS-1和485 bp的ITS-2核苷酸序列,其中分别包括25 bp和22 bp的插入缺失。ITS-1和ITS-2片段的T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为13.6%、30.2%、28.3%、29.7%(ITS-1),16.2%、33.7%、19.5%、30.6%(ITS-2),A+T含量显著低于G+C含量。序列分析显示,野生群体和养殖群体的单倍型多样性指数、多态位点数、平均核苷酸差异数分别为1.0、40、10.54(ITS-1),0.96、27、11.91(ITS-2)和1.0、28、8.23(ITS-1),0.96、28、10.16(ITS-2),揭示出福建两个缢蛏群体的遗传多样性均较为丰富,其变异主要源于碱基的插入和缺失,野生群体的多样性较高于养殖群体,但是遗传组成存在着较高的一致性,群体间没有遗传分化。     

魁蚶4个地理群体ITS序列变异及系统发生分析

为充分了解我国魁蚶种质资源状况,准确定位魁蚶的养殖育种模式,本研究采用聚合酶链式反应(PCR)对采自山东蓬莱(PL)、山东黄岛(HD)、江苏前三岛(QSD)及韩国统营(KTY)4个地理群体魁蚶样本的核糖体RNA两个内转录间隔区域(ITS-1和ITS-2)进行扩增,经测序比对后分别获得长度为468bp和541bp(包含引物、插入/缺失位点)的序列.序列比对结果表明,ITS区序列变异相对较高,但4个群体的碱基组成基本一致；4个群体的ITS区序列均表现出丰富的遗传多样性,HD群体最为丰富,该群体在ITS区序列上的变异位点数也最多,HD和QSD群体共同变异位点多且集中.对不同个体间的遗传距离和分子系统树分析结果表明,ITS序列在魁蚶不同地理群体间甚至个体间存在差异,且ITS-1和ITS-2的变异频率是不一样的,4个群体合计55个个体基于ITS-1序列没有发生明显聚类现象,这4个群体合计56个个体基于ITS-2序列明显聚为PL/KTY、HD/QSD两大类,基于ITS-2序列进行系统发生分析的结果同于课题组之前基于形态度量学分析和分子标记分析的结果；HD群体遗传多样性丰富,而KTY群体遗传变异相对较少,各群体之间存在一定的遗传差异,综合考虑不同群体相对优良的生物学特征,可开展选择或杂交培育良种的研究.     

太平洋牡蛎核糖体DNA转录间隔子和线粒体基因片段序列测定

以相应引物经PCR扩增了太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)的核糖体转录间区域 (ITS 1和ITS 2 )及线粒体 16SrDNA和COI基因片段。PCR产物经T 载体连接后进行克隆和测序 ,分别得到长度为 5 4 3、791、5 30和 70 0bp的核苷酸序列。 4个DNA片段的A、T、G和C碱基含量分别为 2 3.5 7%、2 0 .0 7%、2 9.4 7%和 2 6 .89% (ITS 1) ,2 7.4 3%、19.2 2 %、2 7.0 5 %和2 6 .30 % (ITS 2 ) ,2 9.2 5 %、2 9.2 5 %、2 3.0 2 %和 18.4 9% (16SrDNA) ,2 2 .71%、39.4 3%、2 0 .4 3%和 17.4 3% (COI)。实验证明ITS 1和ITS 2引物在贝类中通用性良好。文中同时讨论了 4个序列在我国几种牡蛎的种类鉴别及相关研究的应用潜力     

金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析

以持异性引物扩增了金焰笛鲷(Lutjamts fulviflamma)的核糖体第一转录间隔区(ITS-1),扩增产物经克隆后测序,测得 ITS-1长度为566 bp。其中 A、T、G、C 4种碱基的含量分别为14.1%、16.1%、30.2%、39.6%,G C(69.8%)含量明显高于 A T 含量(30.2%)。将此引物在笛鲷属其他4种鱼类中扩增,发现该对引物有很好的通用性;比较发现在不同种中 ITS-1存在着较大的差异,适合将其应用于分子系统学和种质资源方面的研究。     

金鱼核糖体转录间隔区(ITS-1)的克隆和序列分析

对金鱼(Carassius auratus)核糖体转录间隔区(ITS-1)进行了克隆测序,并对ITS-1序列进行了分析。结果显示,克隆的金鱼ITS-1区序列长度为294bp,其中A、T、G、C 4种碱基的含量分别为17.0%、14.6%、33.0%、35.4%;与从GenBank中检索到的12种鱼的核糖体DNA序列比较显示,其与12种鱼的ITS-1序列同源性较低,在26.0%~61.6%之间;根据金鱼与其他12种鱼的ITS-1序列的同源性构建进化树,所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。     

中华鳖与砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因序列的比较分析和分子鉴定标记

对中华鳖和砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCR-RbLP分析。研究结果表明：中华鳖、砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段的碱基序列长度相同，均为562bp，其A、T、C、G含量相似，分别为209个(37．2％)、121个(21．5％)、145个(25．8％)、87个(15．5％)和207个(36．8％)、120个(21．4％)、145个(25．8％)、90个(16％)。两序列间共有13处碱基不同，序列差异率为2．3l％，中华鳖与砂鳖各自个体间的平均核苷酸序列差异率分别为0．53％和0．36％，种间差异显著；用内切酶MspⅠ酶切两种鳖的12S rRNA基因片段，在砂鳖中可得到大小为519bp和43bp两个片段，而中华鳖无此酶切位点，这可作为准确鉴别中华鳖和砂鳖的分子鉴定标记。从两种鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段碱基的显著差异和MspⅠ酶切位点的变化，可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。     

养殖褐牙鲆细胞色素b基因序列的初步研究

对养殖褐牙鲆(Paralichthys olivacews)的线粒体DNACytb基因的部分序列进行测定，测得的目的DNA片段的长度为410bp，其A(104bp)、T(119bp)、C(117bp)、G(70bp)4种碱基平均含量分别为25．4％、29．0％、28．5％、17．1％。在28个褐牙鲆个体中共出现了3种单倍型。白化褐牙鲆出现的第1种和第3种单倍型个体数分别为10尾(占白化褐牙鲆样本数的如90．91％)和1尾(9．09％)；6尾黑化褐牙鲆均出现第1种单倍型(100％)；正常褐牙鲆出现的3种单倍型尾数分别为7尾(占正常褐牙鲆样本数的55．56％)、2尾(22．22％)和2尾(22．22％)；测得的序列与既知序列间在第6bp、第19bp和第402bp碱基处出现差异。由于褐牙鲆Cytb基因的高度同源性，研究其白化、黑化和正常状态时出现的序列差异，对于寻找褐牙鲆白化机理研究的分子标记意义重大。     

基因条码在条斑紫菜(Pyropia yezoensis)不同品系间种质鉴定中的适用性

为寻找适宜的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)品系间种质分子标记鉴定法,利用4种基因条码(RUBISCO Spacer、UPA、Cox2-3和ITS-5.8S)对产自中国和日本的6个条斑紫菜品系的亲缘关系进行了分析研究.结果显示,在6个条斑紫菜品系中,上述4种基因条码的序列同源性较高,同源性为97.8％-100％,其中,RUBISCO Spacer序列的同源性为100％.UPA序列的同源性分析结果显示,在中国产的LS、B4、HT和TM18品系中,该序列完全相同,但与日本产的GT和ROS-2两个品系的序列有差异,该序列的同源性为99.2％.在6个品系中,Cox2-3和ITS-5.8S序列的同源性相对较低,分别为97.8％-99.2％和98.4％-99.8％.根据UPA、Cox2-3和ITS-5.8S基因条码通过邻接法构建的系统进化树显示,依据ITS-5.8S和UPA序列均能分别区分中国产的4个品系(LS、B4、HT和TM18)与日本产的两个品系(GT和ROS-2),分别形成两个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系一致.但利用ITS-5.8S序列均能对中国产的4个品系和日本产的两个品系进行再区分,而利用UPA序列却无法对中国产的4个品系进行再区分,只能区分日本产的两个品系.使用Cox2-3序列则将GT、ROS-2、LS和TM18这4个品系聚成一个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系不一致.上述结果说明,利用ITS-5.8S序列对本研究的6个条斑紫菜品系进行种质鉴定,效果最好.     

背角无齿蚌和三角帆蚌的rDNA基因ITS1及ITS2序列的初步研究

对背角无齿蚌(Anodonta woodiana woodiana)和三角帆蚌(Hyriposis cumingii)的核糖体RNA内转录间隔区1(ITS1)和内转录间隔区2(ITS2)进行扩增测序。结果显示,背角无齿蚌(A.woodiana woodiana)的ITS1长度为496bp(A:20.36%;T:25.40%;G:27.42%;C:26.82%);ITS2长度为466bp(A:24.89%;T:21.89%;G:26.39%;C:28.83%);三角帆蚌(H.cumingii)的ITS1为475bp(A:21.47%;T:23.79%;G:29.36%;C:25.48%);ITS2为519bp(A:25.82%;T:22.93%;G:25.24%;C:26.01%)。研究表明ITS在不同科的物种间差异较大,不适合用于高阶元的系统发育研究。背角无齿蚌、三角帆蚌、魁蚶、栉孔扇贝、大珠母贝5个物种的ITS2中有一段保守序列,推测可能与ITS的某一功能有关。     

洪湖碘泡虫PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种灵敏、特异的快速检测异育银鲫寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的方法,本研究根据洪湖碘泡虫ITS-5.8S r DNA基因序列筛选出一对特异性引物Mh F/R,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并通过特异性试验、灵敏性试验与临床检测验证其可行性。结果显示,建立的PCR检测方法能特异性扩增洪湖碘泡虫相应的基因片段,长度为479 bp,而对试验中其他9种粘孢子虫的扩增结果均为阴性;最低能检测0.1 pg的虫体基因组DNA。通过临床样品检测,PCR方法比显微镜检测的检出率提高了19.5%。结果表明,该PCR方法特异、灵敏,适用于洪湖碘泡虫的快速检测。     

4 种大型水母类ITS-5.8S rDNA 序列分析及其在钵水母类系统分析中的应用

由于钵水母类生物地理学研究的缺乏以及不同时期形态变异较大等原因,对其分类鉴定比较混乱和困难。为弥补形态学分类的缺陷,采用通用引物PCR扩增法,测定了分布于黄海北部和辽东湾海域海蜇(Rhopilema esculentum)、沙蜇(Nemopilema nomurai)、海月水母(Aurelia sp.)、白色霞水母(Cyanea nozakii)4种大型水母的ITS-5.8S rDNA序列,同时利用Gen Bank数据库中已有的钵水母纲(Scyphomedusae)ITS1(the Ribosomal First Internal Transcribed Spacer)同源序列对其进行序列分析并构建系统树,分析ITS1序列片段在大型水母种类鉴定方面的可行性及其在钵水母类系统及演化中的应用。结果显示,4种水母的ITS-5.8S rDNA序列变异较大且具有明显的序列长度多态性,序列长度范围675~833 bp。钵水母纲很多种类的ITS1序列具有种内长度多态性现象,这种长度多态性主要是由于微卫星重复次数不同所造成的。钵水母纲科间遗传距离为0.295~0.491,种间遗传距离为0.024~0.812;除白色霞水母和海蜇外,种内个体间遗传距离为0.000~0.099。采用ML法(maximum likelihood)和贝叶斯法(Bayesian)构建的分子系统树拓扑结构不完全相同且与形态分类学的观点不太一致。研究表明,ITS基因序列在钵水母纲不同阶元间变异较大,适合于钵水母纲种类鉴定和属内种间水平的系统进化研究。     

基于rRNA基因ITS-1序列探讨扭蚌和反扭蚌的分类地位

测定并比较了扭蚌和反扭蚌的ITS-1序列，以三角帆蚌为外类群，利用Mega2．0软件中的最大简约法（MP法）和邻接法（NJ法）构建它们的系统发育树，试验结果表明，扭蚌和反扭蚌聚在一起形成一分支，三角帆蚌形成另一独立的分支；由此推断，扭蚌和反扭蚌属同物异名。     

Phylogenetic analysis and species identification of popular shrimp species in southeast China using the first internally transcribed spacer of ribosomal DNA

The ribosomal DNA internally transcribed spacer 1 (ITS1) was investigated in the search for an appropriate genetic marker that was suitable for phylogenetic study and species identification of eight major exported shrimp species in southeast China. Using the selected primers, the amplified ITS1 sequences exhibited a high degree of length polymorphisms, ranging from 448 bp in Metapenaeopsis dalei to 1491 bp in Macrobrachium nipponense . Many microsatellite loci were found at the 5' end and in the middle region of ITS1, which seemed to be associated with intragenomic sequence variation among samples of the same species. This variation might obscure the phylogenetic relationship between some shrimp populations, but the separation of five Penaeus species was well supported. In combination with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymerism methods analysis, ITS1 sequences from shrimp species belonging to different families and genera could also be easily discernable. The results suggested that ITS1 was highly variable among different shrimp groups and could be an appropriate marker for species identification and molecular systematic studies.     

Molecular divergence and application of the ITS-5.8S rDNA and RUBISCO spacer in <Emphasis Type="Italic">Porphyra haitanensis</Emphasis> Chang et Zheng (Bangiales,Rhodophyta)

To select a reliable and sensitive method for discriminating strains of Porphyra haitanensis, the nucleotide sequence of the internal transcribed spacer 1 to internal transcribed spacer 2 regions (ITS-5.8S) of nuclear ribosomal DNA and the intergenic spacer region of RUBISCO were compared in five wild and five cultivated Porphyra haitanensis strains. Based on molecular analyses, sequences of ITS-5.8S (about 1,210 bp) could be divided into three regions: ITS1, 5.8S, and ITS2. The ITS1 and ITS2 sequences of each strain differed, even between individuals collected from the same site. In contrast, 5.8S rDNA and RUBISCO spacer sequences were identical among the ten P. haitanensis strains, although differences were found among different Porphyra species. Phylogenetic analysis also supported these conclusions. These sequence features of highly conserved regions and diversified regions that occurred repeatedly in ITS-5.8S could be useful in discriminating germplasm of P. haitanensis strains or Porphyra species. In contrast, the RUBISCO spacer is only suitable for identifying Porphyra species. New coupled primers were designed to amplify only the 5.8S rDNA and ITS2 region of Porphyra. The sequences of these amplified fragments can be readily used to identify germplasm or to perform phylogenetic analysis of Porphyra spp.     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间，尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间，很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析，以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp，测序结果表明，（去除引物后）18S长146bp，5．8S长66bp，不同种类之间无差异；ITS1长383-483bp，因种类不同而异，其GC含量大于AT含量，达到67．1％。序列比对分析结果表明，18S和5．8s片段高度保守，但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开；18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点，可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大，系统发育分析表明，所研究的5个种聚成2个类群，尼罗与尼奥罗非鱼为一组，莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小，尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006；莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间；两组罗非鱼之间的遗传距离较大，在0．030-0．035之间，表明罗非鱼ITS1序列多态性较高，适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列，细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

福建沿海不同养殖区泥蚶的ITS-1基因片段序列分析

泥蚶是福建省重要的经济海水养殖贝类,不同地区的泥蚶品质相差较大,其中以生长在宁德飞鸾铁基湾和东山湾竹塔的泥蚶品质较佳.本实验克隆了福建沿海六个养殖区的六个泥蚶的ITS-1序列,测序后,进行序列分析,并构建了ME、NJ和UPGMA系统树.结果表明:不同养殖区的泥蚶在DNA水平上的差异不大,遗传相似度为97.01～99.76%;所分析的六个群体未形成明显的地理隔离;福建泥蚶在品质上的差异没有体现在基于ITS基因序列分析的遗传差异中.