坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

坛紫菜色素突变体色素基因的表达定量分析

以野生型和6种不同色泽的坛紫菜色素突变体为材料,通过实时荧光定量PCR技术分析了4种主要色素基因(Cpeα、Cpcα、Apcβ、Chl.a)在不同色泽突变体不同生长期(初期、盛期、末期)的相对表达水平。结果表明在不同色泽不同生长期的坛紫菜色素突变体中,各色素基因表达水平由高到低均为Apcβ>Cpcα>Chl.a>Cpeα,且Cpeα基因的表达水平最不稳定,会随着生长过程发生显著变化,而Cpcα、Apcβ和Chl.a基因表达水平则相对稳定;此外,对色素突变体和野生型藻体中色素基因表达水平和相应色素蛋白含量的线性相关回归分析结果表明二者间没有相关性,即各色素基因的表达水平与藻体最终显示的颜色无关,由此推测坛紫菜色素突变的可能机制是色素蛋白合成过程中一些相关调控基因突变所致。     

凡纳滨对虾6-磷酸海藻糖合成酶在抗高温胁迫中的表达特征

6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase, TPS)是海藻糖合成的关键酶,在生物体逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高温胁迫转录组测序的Unigene序列为基础,采用直接PCR扩增的方法,获得了TPS部分cDNA (完整的ORF和部分UTR)序列(LvTPS)。序列分析结果显示,LvTPS序列包含1个2529 bp的开放阅读框,可编码842个氨基酸,分子量为95.4 kDa,等电点为6.17。LvTPS具有Glyco-transf-20和Trehalose PPase 2个功能结构域。多序列比对结果显示,LvTPS与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性最高,为63.73%;系统进化树显示,凡纳滨对虾与中国对虾亲缘关系最近,并与蓝蟹(Callinectes sapidus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)等无脊椎动物聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。基因表达水平的定量分析结果显示,LvTPS在鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉6种组织中均表达。鳃和肌肉表达量基本相同,为最高;眼柄、心脏和神经表达量次之,显著低于鳃和肌肉中的表达量(P<0.05);肝胰腺中表达量为最低,显著低于其他5种组织中的表达量(P<0.05)。与26℃温度下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,眼柄和心脏中的LvTPS显著上调表达(P<0.05);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS显著上调表达(P<0.05)。其中,在肝胰腺中表达量变化较显著。之后,随着温度的下降,其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中,不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。上述研究结果表明,LvTPS与凡纳滨对虾应对高温胁迫过程密切相关。本研究可为解析凡纳滨对虾应答高温胁迫机制提供一些基础数据。     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

坛紫菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达特征

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是植物活性氧(ROS)清除酶促系统的重要成员之一,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料采用RACE技术克隆获得了一条坛紫菜的GPX全长基因序列,命名为PhGPX(Gen Bank收录号:JX673908)。该基因序列全长1027 bp,包含555 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含184个氨基酸,分子量为19.9 k D,等电点为8.76。多序列比对和系统进化树分析结果表明Ph GPX属于植物GPX基因家族成员。基因表达水平的q PCR分析结果表明Ph GPX基因在坛紫菜叶状体和丝状体世代中的表达水平没有显著差异;高温胁迫不同时间水平下,Ph GPX基因的表达水平呈现为先上调后下调的趋势;不同失水胁迫条件下,Ph GPX基因的表达不受低水平的失水胁迫影响,但可被高水平(40%)的失水胁迫所抑制,且在复水30 min后仍然无法恢复失水胁迫前的水平。由此推测坛紫菜体内的GPX也可能存在多种家族成员,不同的逆境胁迫条件、甚至不同的逆境胁迫水平可能需要不同家族成员的GPX参与ROS的清除和防御。     

坛紫菜丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及表达特征

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

条斑紫菜半胱氨酸合成酶基因的电子克隆与分析

从网络共享的条斑紫菜(PorphyrayezoensisUeda)表达序列标签(expressed sequencetag,EST)数据库检索出与拟南芥(Arabidopsis thaliana)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase,CSase)基因高度相似的EST序列,构建EST叠连群(contig),并依据contig设计引物.提取条斑紫菜叶状体总RNA,采用RT-PCR方法,扩增得到了条斑紫菜半胱氨酸合成酶基因(PyCSase-B)的cDNA序列(GenBank accession:FJ232911).该cDNA序列含有长1 152 nt的完整开放阅读框,编码产物(PyCSase-B)的分子量39.3 kD,长383 AA.PyCSase-B的N端前60个氨基酸残基构成了叶绿体转运肽序列,成熟的PyCSase-B定位在叶绿体中.PyCSase-B与紫红紫菜(P.purpurea)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、拟南芥和水稻(Oryza sativa)的序列一致性分别为94%、69%、64%和65%,进化树显示PyCSase-B在进化上处在细菌和高等植物之间.PyCSase-B含有与5'-磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5'-phosphate)和O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine)结合的保守氨基酸残基和序列,含有将硫转移到半胱氨酸的保守残基;成熟PyCSase-B单体的三维结构与拟南芥CSase相似,由2个α/β结构域组成.PyCSase-B的成功克隆与生物信息学分析有助于进一步研究其在条斑紫菜抗逆调控中的作用.     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因cDNA全序列克隆及表达分析

采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等组织中均有表达,在外套膜中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;经嗜水气单胞菌诱导后,各个组织的表达量出现明显上调的趋势且与对照组显著差异,推测theromacin基因可能在背角无齿蚌的免疫反应中起重要作用。     

坛紫菜有丝分裂阻滞缺陷蛋白2基因(Ph-mad2)的克隆及其在单性生殖过程中的表达

为探究坛紫菜雌配子体单性生殖过程的细胞二倍化机制,实验基于坛紫菜雌性配子体的转录组信息,克隆和分析了坛紫菜的有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(PhMAD2)基因(Phmad2),同时对其在坛紫菜单性生殖发生过程中处于不同发育时期的细胞中的表达特征进行了初步研究。结果显示,坛紫菜Ph-mad2基因的cDNA的完整开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸,分子量为23.8 ku。从氨基酸序列比对结果可知,坛紫菜PhMAD2蛋白中所具有的典型的HORMA结构域和保守的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,均与团藻和莱茵衣藻MAD2蛋白相同。系统发育分析表明,坛紫菜与藻状菌纲的异丝水霉和寄生水霉的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测显示,与可进行正常有丝分裂的营养细胞相比,在坛紫菜单性生殖过程中发生细胞二倍化的生殖细胞和单性孢子时期,Ph-mad2基因的表达量显著下降;但是,在随后可进行正常有丝分裂的单性孢子萌发体细胞和处于营养生长期的单性孢子体细胞中则表达上调。这一结果暗示Ph-mad2基因的表达下调可能阻碍了坛紫菜单性生殖初期单倍体细胞进行有丝分裂时纺锤体组装检验点的形成,在一定程度上致使它们发生了染色体加倍。     

一株引起坛紫菜绿斑病病原的分离鉴定及致病性研究

为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为10⁴~10⁸ cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。     

拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

高光胁迫下坛紫菜定量PCR内参基因的筛选

为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBC、TUB、18S、EF2、ACT和GAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、Ge Norm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;ge Norm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBC和EF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。     

中华绒螯蟹蜕皮激素受体基因（Ers-EcR）的克隆和组织表达分析

蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结构(C156-C159-C173-C176、C192-C198-C208-C211),是典型的DBD特征。多重序列比对分析表明,Ers-EcR氨基酸序列与拳手招潮蟹同源性最高,达到91%。荧光定量PCR结果显示成体中华绒螯蟹ErsEcR基因在Y-器官和肌肉组织中表达量最高,在血液、肠道、卵巢、眼柄、心脏和肝胰腺中有一定表达,在鳃、胸神经节和精巢表达量较低。这表明Ers-EcR基因在中华绒螯蟹各组织器官中的表达不具有典型的特异性,提示Ers-EcR基因可能参与体内多种生命活动的调控。