仿刺参甘露聚糖结合凝集素基因对脂多糖刺激的免疫应答

甘露聚糖结合凝集素是天然免疫系统中重要的模式识别分子。分析了仿刺参甘露聚糖结合凝集素在仿刺参不同组织及脂多糖刺激前后的表达规律,结果显示仿刺参甘露聚糖结合凝集素mRNA在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有组成型表达,且体壁的表达量最高;细菌脂多糖刺激后,4个组织的仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量均得到上调,且以肠道和体腔细胞表达量的变化最为显著;另外,肠道、体腔细胞、体壁中仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量峰值的出现具有明显的时序性,而呼吸树自刺激后6h直至取样结束,其表达量呈稳步上升趋势。     

可口革囊星虫体壁形态和组织学结构

试验结果表明,可口革囊星虫吻长与躯干长之比介于1与2之间,体壁由外到内依次由角质层、上皮、环肌层、纵肌层和壁体腔膜组成。角质层是由上皮细胞分泌而成的非细胞结构,外突形成乳突且在吻顶端特化为钩,乳突顶端含有棕色颗粒物质;上皮薄,为单层柱状上皮;肌肉发达,外环内纵,纵肌成束状分布;体壁的最内为壁体腔膜,由单层上皮细胞组成,朝体腔侧有具纤毛细胞的存在。AB-PAS染色显示体壁仅有少量混合黏液细胞存在。     

仿刺参基质金属蛋白酶基因MMP-16的克隆及表达

基质金属蛋白酶(MMPs)是一种能够降解细胞外基质的蛋白水解酶类。为研究MMPs在仿刺参免疫防御中的作用,本实验采用RACE技术克隆了仿刺参基质金属蛋白酶16基因(Aj-MMP-16)的cDNA全长序列,并对其序列特征和功能进行了初步分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分别分析了Aj-MMP-16基因在仿刺参不同组织、不同"化皮"体壁组织以及病原菌刺激后体腔细胞中的表达情况。结果显示,Aj-MMP-16基因的cDNA全长为2 976 bp,包括一个342 bp的5′非编码区,一个963 bp的3′非编码区;开放阅读框(ORF)为1 671 bp,编码557个氨基酸,预测蛋白分子量为63.11 ku,等电点为4.79。Aj-MMP-16具有典型的MMPs家族蛋白结构:N-端前肽区、铰链区、催化区、C-端类血红素结合区和跨膜区。Aj-MMP-16与其他物种的MMPs具有一定的相似性,与紫色球海胆的MMP-16相似性最高。Aj-MMP-16基因mRNA在仿刺参各组织中均有表达,表达量由高到低为呼吸树、肠、体腔细胞、管足、肌肉、体壁;在"化皮病"不同阶段,AjMMP-16基因mRNA在"化皮"体壁组织中的表达量显著高于正常体壁组织;灿烂弧菌和蜡样芽孢杆菌刺激后,体腔细胞中Aj-MMP-16基因mRNA表达量显著升高。Aj-MMP-16基因可能在仿刺参内脏再生、炎症发生以及免疫应答中起着重要的作用。     

α-tubulin基因的克隆、生物信息学分析及其在仿刺参肠道再生过程中的表达模式

为了明确仿刺参α-微管蛋白(α-tubulin)基因的序列及结构信息,初步研究该基因在仿刺参肠道再生过程中的生物学功能,本研究利用转录组数据挖掘和c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆得到仿刺参α-tubulin基因的全长c DNA序列。结果表明,仿刺参α-tubulin基因c DNA全长为1641 bp,共编码453个氨基酸,经生物信息学分析发现,该基因的5'端非编码区为153 bp,3'端非编码区为126 bp,推算该基因所编码的蛋白质分子量为50.33 ku,等电点为4.89,属于亲水性非跨膜蛋白质,且氨基酸序列中含有微管蛋白特有的信号序列GGGTGSG。通过与13种已公布物种的α-tubulin氨基酸序列进行多重序列比对及系统进化分析,发现仿刺参α-tubulin蛋白的氨基酸序列与其他真核生物的α-tubulin蛋白序列具有非常高的保守性,与南极岩斑鳕α-tubulin相似性高达90%。采用实时定量PCR技术对α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期的表达情况进行检测,结果显示α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期均有表达,其相对表达量在肠组织再生17 d时最高,5 d时最低。本研究在获得仿刺参α-tubulin基因结构信息的同时,进一步印证了真核生物α-tubulin基因的高度保守性,同时表明α-tubulin基因参与仿刺参肠道再生过程。     

基于卷积神经网络的仿刺参非侵入式标记方法的初步研究

使用体外标记技术可对仿刺参(Apostichopus japonicus)进行种群和个体尺度上的时空行为学研究、种群动态研究、良种繁育、高效采捕方法的研究。由于仿刺参体壁柔软, 排异能力较强, 使得传统的侵入式标记方法留存率较低; 且传统标记对体壁的破坏会导致伤口溃烂, 影响仿刺参的正常生活。为研发非侵入性的仿刺参识别技术, 本研究利用深度学习中的卷积神经网络模型, 对仿刺参图像进行特征提取, 该特征能够表征个体独特的体表纹理模式。对 50 d 内连续拍摄的仿刺参图像进行特征提取并训练分类器后, 发现分类器在测试集上最高可达到 0.996±0.011 的精度; 而传统的侵入式标记方法最高只能达到约 0.75 的精度。对实验仿刺参个体进行个体识别跟踪, 使用前 25 d 的仿刺参图像进行特征提取并训练模型, 对后 25 d 的图像进行预测, 可达到 0.946±0.058 的精度。实验结果表明, 使用 ResNet50 卷积神经网络可有效地对仿刺参进行预测, 并在时间追踪任务中取得优于传统标记方法的精度。     

普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参不同组织基因组DNA的MSAP研究

本研究分别以普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参基因组DNA为实验材料,应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术对刺参体壁、呼吸树和消化道3个组织的DNA甲基化水平和甲基化模式进行了研究,初步探讨了DNA甲基化对刺参组织间基因特异性表达的影响.结果显示,筛选得到的9对引物组合能够在普通刺参和白刺参两个群体中得到稳定扩增,在两群体刺参中分别检测到5932和5208个位点,均以未甲基化位点为主,普通刺参和白刺参未甲基化位点数分别为4317和3944,分别占总扩增条带数的72.78％和75.73％.普通刺参体壁的甲基化水平为31.07％,呼吸树为23.36％,消化道为26.34％;白刺参中体壁的甲基化水平为29.88％,呼吸树为23.25％,消化道为19.45％,由此可见,体壁的甲基化率在两群体中是最高的.普通刺参和白刺参同一组织间的甲基化水平和甲基化模式不同,同一群体体壁、呼吸树和消化道不同组织间的甲基化水平和模式也不同.甲基化在普通刺参和白刺参组织分化和发育过程中可能发挥着十分重要的作用.在检测的3个组织中,CCGG序列的全甲基化位点较半甲基化位点多.     

刺参尾部再生过程中形态组织细胞学初步研究

刺参(Apostichopus japonicus Slenka)属于棘皮动物,具有很强再生能力,是中国重要的经济养殖种类。目前相关研究集中于由于诱导或自发排后的消化道再生,但是缺乏创伤后的机体修复再生(比如尾部再生)方面的研究。本研究利用传统形态学观察和组织细胞学技术对刺参尾部再生过程进行了初步探讨。研究发现,海参尾部手术切除后,可以进行再生,约15 d基本可以完成再生。海参尾部的再生类似于脊椎动物的割处再生(epimorphosis),再生时期可以分为创伤愈合期、再生胚基期和细胞分化期3个阶段。海参尾部再生过程中发生了组织溶解、组织重塑、细胞去分化、细胞增殖、细胞迁移以及细胞再分化等现象。其中,原有的肌肉细胞呈现了典型的去分化特征:肌纤维发生了明显的片段化,进一步形成小的类间质细胞。这些细胞有两个发育方向,其中一部分细胞就近再分化为肌肉细胞,进一步发生融合形成新的肌纤维;另一部分细胞则是可能迁移到伤口附近,在那里聚集和增殖,形成再生胚基。再生胚基的细胞进一步迁移和分化形成结缔组织中的成纤维细胞,参与皮下结缔组织的构建。另外,用Pax7抗体对再生的组织进行了荧光免疫组化反应,结果显示,再生过程中没有检测到明显的阳性信号,表明此过程中肌肉干细胞(卫星细胞)可能不起主要作用。本研究旨在通过阐明海参尾部再生特征,为海参养殖生产过程中正确处理和评价受伤的海参提供理论依据。     

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列,并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951bp,其中5′-末端非翻译区为397bp,3′-末端非翻译区为666bp,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸,N端16个氨基酸为信号肽,信号肽后面有两个G-X-Y重复序列,C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律,结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达,且肠道的表达量最高;脂多糖刺激后,4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化,且以肠道和体壁表达量的变化最为显著;此外,仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性,表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。     

仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析

表皮生长因子受体(EGFR)是多种细胞因子的受体,在细胞增殖、迁移及分化中具有重要的作用。应用RACE法首次从仿刺参体腔细胞中克隆出EGFR基因的全长cDNA序列。该cDNA全长3 826 bp,包括821 bp的5’-UTR,281 bp的3’-UTR,开放阅读框2 724 bp,编码907个氨基酸。推导的氨基酸序列55-184aa和365-487aa符合EGFR基因所具有的L1和L2受体结构域,在203-344aa和503-823aa含有EGFR家族特征区域CR1和CR2半胱氨酸富集区,并同为跨膜糖蛋白,在结构上具有一致性。经BlastP与GenBank已知物种氨基酸序列进行同源性比对,仿刺参EGFR基因氨基酸序列与果蝇EGFR相似性为49%,同源性为34%,与斑马鱼EGFR相似性为47%,同源性为34%,与淡水椎实螺EGFR相似性为49%,同源性为31%。据此推断,仿刺参EGFR基因属于EGFR家族成员。利用Real-time PCR技术检测了该基因在仿刺参各组织中的表达,结果显示在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中EGFR均有表达,且体腔细胞和表皮表达量较高。结果表明,该基因可能在仿刺参组织发育和再生过程中起到重要的调控作用。     

仿刺参内脏再生过程的能量代谢及生化组成变化

通过人工注射KCl（0.35mol/L）诱导仿刺参（Apostichopus japonicus）排脏,将水温控制在（18±0.5）℃条件下对其消化道和呼吸树再生过程中的能量代谢及生化组成进行了研究。结果表明,仿刺参排脏后停止了一切摄食和排粪,16d消化道打通后开始摄食。在整个再生过程中,仿刺参摄食前体质量出现了负生长现象,实验结束时体质量比对照组降低了36.74%。耗氧率和排氨率同对照组相比均有显著变化,耗氧率最低为3.29μg（O2）/（g·h）,排氨率最低为0.0556μg/（g·h）,再生对仿刺参身体生化组成也有显著影响（P〈0.05）,实验结束时蛋白质,脂肪和体能值分别减少了15.58%、22.58%和24.71%。结论认为,再生对仿刺参营养物质的利用情况的影响要高于环境因子。