可口革囊星虫生殖周期的观察

通过对可口革囊星虫体腔生殖细胞的发育和形态特征的周年观察,逐月统计体腔卵母细胞的数量,研究其变化趋势。结果表明,可口革囊星虫雌雄异体,性比为1∶1,无可见的生殖腺结构,原生殖细胞在体腔液中发育。体腔内全年都有生殖细胞存在,排卵期与产卵期出现重叠现象,卵母细胞分批成熟,分批产卵。根据卵母细胞的形态特点和存在方式可分为5个发育阶段:细胞增殖期、细胞质生长期、胶质膜形成期、成熟前期和成熟期。雄性生殖细胞在成熟之前,以细胞团的形式存在于体腔液中,其发生和产出过程,在时间上与卵母细胞同歩。成熟的生殖细胞经肾管排出、体外完成受精。宁德地区可口革囊星虫的生殖季节为5~9月,其中7~8月为繁殖盛期。体腔卵母细胞的长径与短径呈线性关系:Y=1.14X-0.7316(R2=0.9711)。     

RNA干扰Gas2基因对低温胁迫下罗非鱼肾脏细胞系增殖及凋亡的影响

探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1 (PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P＜0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1mRNA表达量最高(P＜0.05).采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过qRT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测.结果显示,20IU/mlHCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系.HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P＜0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用.PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料.     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1(PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05)。采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过q RT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测。结果显示,20 IU/ml HCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系。HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用。PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料。     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。     

牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。     

绵羊TIMP1基因克隆及真核表达载体的构建

为探究TIMP1基因在绵羊卵巢组织中的生物学功能及在繁殖调控中的作用机制。研究以绵羊卵巢组织为材料,提取RNA后采用RT-PCR技术检测TIMP1基因在产多胎和产单胎绵羊卵巢组织中的差异表达情况,另外利用PCR技术扩增得到绵羊TIMP1基因编码序列,共编码207个氨基酸。构建TIMP1基因的真核表达载体,利用限制性内切酶双酶切后插入pEGFP-C1载体中。提取质粒利用脂质体转染至HEK 293F细胞中,验证真核表达载体的表达情况,为进一步探索TIMP1基因的生物学功能及繁殖调控机制提供良好的基础材料。     

病毒感染过程中青鳉irf2基因过表达的双面性

为了探究干扰素调节因子2 (interferon regulatory factor,IRF2)如何通过调控干扰素(IFN)表达影响鱼类的免疫,实验从青鳉中克隆了irf2 (Olirf2),发现该基因在青鳉各个组织中均有表达;将构建的真核表达载体pTol2/CMV-IRF2/IE1-pr转染到胖头鱥肌肉细胞系(FHM)后,发现瞬时过表达Olirf2能够显著促进鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)的复制,并抑制抗病毒相关基因mx1、ifn和irf3的表达。进一步通过双荧光素报告系统发现,Olirf2能够显著抑制NF-κB和ISRE的活性,说明Olirf2可能通过抑制细胞的天然免疫应答进而促进病毒的增殖。然而持续过表达Olirf2则增强了细胞的抗病毒能力,同时促进干扰素相关基因mx1、ifn和irf3的表达。因此,Olirf2基于表达的持续时间不同而具有抗病毒或者促病毒的双面效果。实验通过研究Olirf2在抗病毒信号通路中发挥的作用,为通过基因编辑或者转基因手段来构建抗病毒的鱼类提供了理论基础。     

传染性造血器官坏死病毒微型基因组表达干扰素对病毒的抑制效应

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。     

翘嘴鳜学习记忆相关基因c-fos对食欲基因的调控

学习记忆在动物获得新的觅食技巧和食物偏好方面扮演着重要的角色。为评估学习记忆对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)摄食调控的影响, 构建翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 及 zif268 荧光过表达载体, 并以 pcDNA3.1-EGFP 载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验, 优化电压、脉冲时间、质粒浓度和电击次数等电转条件, 确立最佳条件。利用电击的方式转染翘嘴鳜脑细胞, 检测食欲基因 mch、agrp、pomc、npy 表达变化。结果显示, 成功构建了学习记忆过表达载体 pcDNA3.1-c-fos-EGFP、pcDNA3.1-zif268-EGFP。翘嘴鳜脑细胞电转染的最适条件: 细胞密度 1×106 /mL、电压 240 V、脉冲时间 5 ms、质粒 6 μg、电击 1 次、转染 48 h, 可见大部分荧光蛋白表达, 转染率较高, 表明 pcDNA3.1-EGFP 在体外成功转染翘嘴鳜脑细胞。过表达 c-fos 基因后, 食欲相关基因 pomc 和 npy mRNA 水平均显著上升。而过表达 zif268 基因后, 并未发现食欲基因有差异表达。以上结果说明, 翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 的表达影响了食欲相关基因 pomc 和 npy 的表达。     

RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24～48h,实验细胞(共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46)和阳性对照细胞(共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46)中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照(共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46)少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72h其与阴性对照组已差别不大。说...     

RNA干扰技术抑制新家坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus，SGIV）是一种严重的能引起全身性疾病的病原体，对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46（infected cell polypeptides 46）基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞（fathead minnow cells，FHM）中进行融合表达，用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV-ICP46的序列，设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV-ICP46的siRNA（siRNA-ICP46），与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中，通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24~48 h，实验细胞（共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46）和阳性对照细胞（共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46）中的荧光微弱，发荧光的细胞数量较阴性对照（共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46）少70%左右，但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强，在转染后72 h其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24~48 h可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV-ICP46基因的表达。     

中华绒螯蟹卵巢EJ01基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

扩增中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢EJ01（GenBank检索号：AYl85917）的cDNA全序列得到编码区序列，并将其插入原核表达载体pET28b中，构建成表达质粒pET28b-EJ01。该表达质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，得到EJ01-HIS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明，该融合蛋白的相对分子质量约为32000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJ01-HIS6融合蛋白。     

中华绒螯蟹卵巢EJO1基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

扩增中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢EJO1基因(GenBank检索号:AY185917)的cDNA全序列得到编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28b中,构建成表达质粒pET28b-EJO1。该表达质粒在大肠杆菌(Esche-richia coli)BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到EJO1-H IS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该融合蛋白的相对分子质量约为32 000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJO1-H IS6融合蛋白。     

Establishment and characterization of an ovarian cell line from Southern catfish (Silurus meridionalis)

An ovarian cell line was successfully developed from the juvenile ovary of Southern catfish (SCO1) (Silurus meridionalis), which was designated as SCO1. The cell line multiplied preferentially in L-15 medium with 15 % fetal bovine serum at 28 °C for more than 70 passages over a period of 420 days. SCO1 showed fibroblast-like morphology and predominantly retained a diploid karyotype of 58 chromosomes. From the gene expression patterns, SCO1 showed a characteristic of ovarian granulosa cells. After the cells were transfected with the green fluorescent protein expression vector, bright fluorescent signals could be observed in approximately 30 % cells. This cell line may be valuable for the evaluation of endocrine disruptors and studying interactions between somatic cells and germ cells.     

东北七鳃鳗NF-κB基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-kB(Nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-kB基因启动子的活性报告基因，进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制，我们根据此前克隆得到的东北七鳃鳗(Lethenteron morii)NF-kB基因cds序列，以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗(Lampetra japonica)同源基因 5’上游启动子特征序列为模板设计引物，克隆获得了东北七鳃鳗NF-kB启动子序列，该序列全长3169 bp，提交至NCBI Genbank获得登录号MN368861。经AliBaba2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点，并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1207-1402 bp处存在CG含量大于50%，长196 bp的CpG岛。利用双酶切技术构建了pGL3-NF-kB-pro重组质粒，并将其转染至人胚肾细胞系（Human embryonal kidney, HEK293T）和鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）中。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示该片段序列在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有启动子活性，同时在HEK293T中经过Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）的配体LPS刺激后启动子活性显著上升。本研究成功构建了东北七鳃鳗NF-kB启动子报告基因，并在不同细胞系中证实了其活性。LPS刺激后的检测结果揭示东北七鳃鳗NF-kB参与了TLR信号通路的免疫应答。东北七鳃鳗NF-kB报告基因的构建为探究原始脊椎动物免疫系统信号传导机制奠定了基础。     

大鲵虹彩病毒MCP蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

为研制基于杆状病毒表达系统的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)新型亚单位疫苗,将CGSIV主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因克隆至杆状病毒穿梭载体p Fast Bac1质粒中,构建了重组质粒p Fast Bac-MCP。转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经PCR筛选和测序获得了阳性重组杆粒r Bacmid-MCP,在昆虫细胞转染试剂介导下将该重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见大量重组杆状病毒存在于细胞中。按不同感染复数(MOI=2、5、10)将重组杆状病毒感染Sf9细胞进行CGSIV MCP的表达。SDS-PAGE检测结果表明,在MOI=10时,目的蛋白的表达量最高;间接免疫荧光观察结果显示,目的蛋白在感染细胞中得到表达,且分布在细胞表面。以抗CGSIV MCP单抗为抗体制备的免疫磁珠纯化目的蛋白并利用兔抗CGSIV MCP多抗血清检测目的蛋白的生物学活性。SDS-PAGE和Western blot结果显示,纯化的目的蛋白纯度很高,而且具有抗原活性,能够被兔抗大鲵虹彩病毒MCP多抗血清识别。利用杆状病毒表达系统成功进行了CGSIV MCP的表达,并应用免疫磁珠法进行了目的蛋白的纯化,为CGSIV新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。     

哲罗鱼胰岛素样生长因子-II的原核表达与活性分析

在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行变性/复性后获得较纯的目的蛋白,利用ELISA和MTT方法对目的蛋白进行免疫学活性及生物学活性分析。ELISA结果显示该目的蛋白能够与商品化的抗鲑鳟鱼IGF-II的抗体发生特异性反应,并且呈现抗原浓度依赖性,该结果说明本研究获得了具有良好免疫原性的IGF-II蛋白;MTT方法测定IGF-II蛋白对鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞(epitheliaoma papulosum cyprini,EPC)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞(rainbow trout gonad,RTG-2)的增殖效果来鉴定IGF-II蛋白的生物学活性,结果显示所表达的哲罗鱼IGF-II蛋白能够有效的刺激EPC细胞和RTG-2细胞增殖。该结果表明利用原核表达系统获得的哲罗鱼IGF-II蛋白具有良好的生物学活性。本研究为哲罗鱼的生长模式和生长繁殖的研究奠定了基础。     

褐牙鲆中miRNAs与甲状腺激素受体TRβ的相互作用研究

甲状腺激素通过与其受体结合对褐牙鲆变态起重要的调控作用,而miRNAs通过结合靶基因3′-UTR在转录后水平调节靶基因的表达。为探讨miRNAs在褐牙鲆变态中的作用,通过生物信息学方法预测褐牙鲆TRβ基因3′-UTR存在的miRNAs结合位点,并利用3′-RACE方法克隆TRβ基因的3′-UTR序列,通过体外DNA重组技术构建应用于miRNAs靶向基因检测的双荧光素酶重组报告载体,利用细胞转染和双荧光素酶报告技术分析多个miRNAs与TRβ基因的作用关系。研究结果显示,克隆得到了一段长为437 bp的褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列,发现3′-UTR序列上存在pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p、pol-miR-138和pol-miR-125a*的结合位点,成功构建了双荧光素酶重组报告载体,命名为pmirGLO-TRβ-3′-UTR。双荧光素酶报告分析结果表明,pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-138均为作用于褐牙鲆TRβ的靶向miRNAs,而pol-miR-125a*对TRβ基因无直接的调节作用。研究结果将为后续深入研究miRNAs与TRβ在褐牙鲆变态发育中的功能及其作用机制提供基础。