鲤病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病鲤(Cyprinus carpio L.)体内分离到一株优势生长菌,人工感染试验证明该菌对鲤有较强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等生物学性状检验;测定了分离菌的16S rRNA和gyrB基因的部分序列,并与相关细菌16S rRNA和gyrB基因序列进行比对后,构建了基于两种基因的系统发生树。结果显示:分离菌所扩增的16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中鳗利斯顿氏菌的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上,其16S rRNA基因序列长度为1449 bp(GenBank登录号:FJ824662),gyrB基因序列长度为1202 bp(Gen-Bank登录号:GQ452957);胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌具有淀粉酶、蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有脂酶活性;在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上,呈β型溶血,分离菌均具有金属蛋白酶基因及溶血素基因。根据分离菌的表型特征及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell1986)的鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等12种药物耐药,对克林霉素等5种药物敏感,对恩诺沙星等32种药物高度敏感。     

锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定

对从病死锦鲤(Cyprinus carpio L.)肝组织中分离的2株菌(编号:HC050630D-1、HC050630D-2)进行了形态特征、理化特性、药物敏感性及对健康鲤鱼的致病作用等方面的检验;测定不HC050630D-1株菌的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树.结果表明,2株被检菌为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii),对健康鲤鱼未呈现明显致病作用;所测菌株的16S rRNA基因序列长度1450 bp,在GenBank中登录号为EF669479,该菌株16s rRNA基因序列与GenBank数据库中不动杆菌属细菌的16S rRNA基因序列同源性为99%;药敏试验结果显示对供试的头孢拉啶等21种药物坚现高度敏感或敏感,对头孢他啶等7种呈低度敏感,对青霉素G等9种耐药.     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

锯缘青蟹细菌性传染病的病原菌研究

从宁波市锯缘青蟹（Scylla serrata)主要养殖海区5－9月间不同症状的病蟹体内分离到6株细菌，S9901、S9902、S9903、S9905和S9906，经感染试验确定S9902、S9903、S9905和S9906均为病原菌；此4株菌革兰氏染色阴性，具1根极生鞭毛，氧化酶反应阳性，发酵葡萄糖，不产气，不发酵肌醇，对0／129试剂敏感，为弧菌属种类；经赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸脱羧酶、蔗糖、甘露醇发酵、6％氯化钠胨水生长、水杨素、枸橼酸盐利用等试验，根据第二代YGZ－9V系统，分别将其归为辛辛那提弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌。4株菌对氯霉素、环丙沙星和硫酸庆大霉素等抗菌素表现出强敏感性，诺氟沙星、磺胺甲异恶唑等中度敏感，而对头孢唑啉钠、呋喃唑酮不敏感；中草药五倍子和五味子煎出液对4株菌均表现出较强的抑菌性能。     

红鳍东方皮肤溃烂病病原菌的分离与鉴定

从体表溃烂的养殖红鳍东方鲀(Fugu obscurus)病灶处分离到1株优势生长菌,编号为H-06091.分别通过创伤浸泡和注射方式感染健康红鳍东方鲀,发现这两种途径均可引发皮肤溃烂,两种途径的感染率均为100%,2×108 cell/mL.菌浓度注射组死亡率为100%,4×107 cell/mL菌浓度注射组死亡率为50%,创伤浸泡感染未见死亡.药敏实验表明,复方新诺明、呋喃妥因、链霉素、环丙沙星、利福平、红霉素、氟哌酸、氟嗪酸、庆大霉素、阿米卡星、四环素、青霉素G等抗菌素对H-06091有较强的抑制作用.按照<常见细菌系统鉴定手册>进行菌种鉴定并测定其16S rRNA基因序列,结果表明,该菌呈革兰氏染色阴性,氧化酶阳性,接触酶阳性,V-P试验阴性,硝酸盐还原反应阳性等特征,符合哈氏弧菌(Vibrio harveyi)特征,其16s rRNA基因序列与GenBank中哈氏弧菌同源性为99%,因此将H-06091鉴定为哈氏弧菌.     

亚东鲑细菌性鳃病病原菌的分离鉴定

2020年9月西藏自治区日喀则市亚东县某养殖基地的亚东鲑出现鳃病症状，主要临床症状为鳃盖打开、鳃丝充血、病鱼离群及呼吸困难。为探究此次疾病的病因，寻找其治疗方法，自患有鳃病症状的亚东鲑鳃组织中分离到1株优势菌YDX-1,采用常规细菌分析、16S rRNA基因序列比对分析和人工感染试验等方法对此株优势菌进行鉴定，同时查明菌株YDX-1的耐药性。试验结果表明，菌株YDX-1为革兰氏阴性菌，在16S rRNA基因序列比对构建的系统发育树中，其与杀鲑气单胞菌聚为一支，相似度达99%以上，结合该菌的形态学特征、生化特性和测序鉴定结果，综合鉴定菌株YDX-1为杀鲑气单胞菌。通过人工感染试验发现，杀鲑气单胞菌YDX-1对亚东鲑的致死率较高，且该菌具有传染性。药敏试验结果显示，杀鲑气单胞菌YDX-1对使用的6类(21种)药物普遍敏感，仅对复方新诺明中介。试验结果对西藏地区亚东鲑细菌性鳃病的防治具有指导意义。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的研究

从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2 株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子、16S rRNA基因序列的测定及药敏试验,研究分离菌的生理生化特征、致病性及药物敏感性.根据2 株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),确定为嗜水气单胞菌.人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又分离到该菌株.2 株菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟等15 种药物均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出菌株差异.对其敏感的15 种药物可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物.     

长鳍真鲨源哈氏弧菌的主要生物学性状研究

从两尾病死的观赏用长鳍真鲨Oceanic whitetip shark，Carcharhinus longimanus L．中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等生物学性状检验。同时，测定了16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发育树。结果表明，8株供试纯培养菌（编号：HQ050226—1至HQ050226—4、HQ050227-1至HQ050227—4）为弧菌属（Vibrio Pacini 1854）的哈氏弧菌（Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936）。所扩增的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区），HQ050226—1株为1463bp（GenBank登录号：EF635305）、HQ050227—1株为1464bp（GenBank登录号：EF635306），与GenBank数据库中哈氏弧菌的同源性在98％及99％。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等33种敏感。     

异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测

2008年10月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病，从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检验；测定了菌株（JY081016-1）的16S rRNA和gyrB基因序列，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性，菌株（JY081016-1）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1448bp（GenBank 登录号：GQ232759），所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp（GenBank 登录号：GQ232760），其16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上；根据分离菌的表型及分子特征，判定分离鉴定的4株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血；设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。     

养殖牙鲆弧菌病病原菌初步研究

1998年 7月自荣成市寻山水产集团总公司养鱼场养殖牙鲆病死鱼体内分离到 1株细菌 ,经人工感染试验证明是牙鲆弧菌病病原菌。该菌主要特征为 :革兰氏阴性 ,弧状 ,以极生单鞭毛运动。氧化酶阳性 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,不产生 H2 S,不产生色素。生长温度范围 10～ 4 2℃ ,p H范围 6～10 ,盐度范围 0 .5～ 6。经 Biolog Microstation System鉴定为河川弧菌 - 。该菌株对环丙沙星、氟哌酸、利福平、呋喃唑酮、呋喃妥因、红霉素、链霉素等药物敏感。     

梭子蟹牙膏病病原菌——溶藻弧菌的鉴定及其系统发育分析

从山东潍坊池塘养殖的患有牙膏病的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中分离到1株病原菌(PX25),经回接感染证实为该病的病原菌。经生理生化试验及形态结构观察显示,该菌株革兰氏阴性,短杆状,直或稍弯曲,两端钝圆;固体培养基上培养后进行染色具有周生侧毛,液体培养基中培养后进行鞭毛染色具一极生单鞭毛;悬滴法观察PX25菌株具有很强的运动性。对其16SrRNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析。结果表明,该菌株与溶藻弧菌亲缘关系最近,相似性达99.35%。综合菌体在形态、生理生化、API20NE与API20E自动鉴定结果、16S rRNA同源性等方面的特性,确认PX25为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。     

仿刺参幼体烂胃病及其致病原鉴定

山东、辽宁两省在仿刺参（Apostichopus japonicus）苗种培育期间的5-7月，耳状幼体易发生一种以胃壁增厚、萎缩、溃烂为主要特征的“烂胃病”。从患烂胃病的耳状幼体中分离到1株细菌LW-1，人工回接感染实验证实其具有较强的致病性，并与自然发病症状相同。通过API半自动化鉴定和常规的生理生化试验的结果表明，LW-1具有弧菌属的特征，其表型特征与灿烂弧菌（Vibrio splendidus）相似。对该菌株16S rRNA基因序列分析和构建系统发生树。结果显示，菌株LW-1与灿烂弧菌的亲缘关系最近，相似率达到99．8％。菌株LW-1可鉴定为灿烂弧菌，并视为耳状幼体烂胃病的致病原之一。通过对多起仿刺参苗期烂胃病的调查研究表明，烂胃病病原也具有多样性和复杂性，并与投喂老化腐败的单胞藻饵料有关。     

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)病原无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

为查明天津地区养殖红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)大量死亡的原因,取患病红尾皇冠鱼进行细菌分离,从病鱼肾脏中分离到优势菌株071901,人工感染试验证实其对红尾皇冠鱼有较强的致病性;采用形态学观察、生理生化特性、16S r RNA基因序列系统发育树分析及cfb(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)基因检测对菌株071901进行鉴定。结果显示,菌株071901为革兰氏阳性球菌,生化特性与链球菌属的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)相近,基于16S r RNA基因序列的系统发育分析将菌株071901与无乳链球菌聚为一支,以071901为模板特异性扩增无乳链球菌的cfb基因,也得到了预期的900 bp的核酸片段,进一步证实菌株071901为无乳链球菌。对30种抗生素的药敏结果显示,菌株071901对红霉素、阿奇霉素等19种药物敏感,对多粘霉素、罗红霉素、呋喃唑酮等11种药物耐药。     

1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析

从养殖的患病军曹鱼身上分离出1株病原菌JT2，革兰氏阴性，短杆状，有极生鞭毛，能运动，菌落半透明。经回归感染实验，证明该菌为军曹鱼病原菌。进行了常规生理生化实验，并用API-ID32E系统鉴定该菌。再经Biolog-GN细菌鉴定系统鉴定，结果JT2与鲨鱼弧菌（Vibrio carchariae）相似度最高。为了进一步确定该菌的分类学地位，测定了其16SrDNA序列，分析了相关细菌的同源性，构建其系统发育树。结果表明，该菌株与V．carchariae的亲缘关系最近。综合上述几种方法的鉴定结果，最后鉴定该株菌为鲨鱼弧菌V．carchariae。     

大黄鱼结节病病原菌—诺卡氏菌的鉴定及其系统发育分析

一株分离自浙江台州、舟山海水网箱养殖患结节病大黄鱼（Larimichthys crocea）的病原菌,经生理生化试验及形态结构观察显示,该菌株革兰氏阳性,好氧,具有弱抗酸性,菌体呈长或短杆状,或细长分枝状,过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性,还原硝酸盐,不水解酪素、黄嘌呤、酪氨酸、淀粉和明胶,能以柠檬酸盐为唯一碳源生长.对其16S rRNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明,该菌株与诺卡氏菌属的菌株亲缘关系最近,与（鱼师）鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea JCM 3360^T）的16S rRNA基因序列相似性达99.9%.据此鉴定结果认为,该菌株为（鱼师）鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）.[中国水产科学,2006,13（3）：410-414]     

异育银鲫类志贺邻单胞菌的鉴定

采用API 20E系列生化鉴定、生理生化特征、电镜观察和16S rDNA序列构建系统发育树分析方法,对从濒死的异育银鲫(Carassius auratus gibelio♀×Cyprinus carpio♂)肝脏中分离到的1株致病菌(革兰氏阴性杆菌,YCS07-01株)进行了鉴定。结果显示:菌株主要生化特性为氧化酶阳性,发酵葡萄糖产酸不产气,分解肌醇;不发酵蔗糖、甘露醇、鼠李糖等;β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性。负染电镜观察,菌株为两端钝圆直杆状,无芽胞,无荚膜,有4根鞭毛,大小为0.8~1.0μm×3.0μm。在以该菌16SrDNA序列(GenBank登录号FJ375179)和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树中,分离菌YCS07-01与类志贺邻单胞菌ATCC14029T(登录号X74688)的同源性为99%,并聚为一个分支。综合培养特征、形态和生理生化特性、系统发育分析等将该菌鉴定为类志贺邻单胞菌(Plesiomus shigelloides)。药敏试验结果表明菌株对羧苄青霉素和万古霉素耐药;对头孢唑啉、四环素和氨曲南中度敏感;对丁胺卡那霉素、左氟沙星、头孢他啶、复方新诺明等高度敏感。     

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。