中国对虾微卫星引物筛选及反应条件优化

对33对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物进行筛选,确定了其中11对引物的最优PCR反应条件,包括各对引物的退火温度、反应体系中引物、Mg2 、dNTPs含量等,为建立微卫星多重PCR技术、最终使微卫星标记成为中国对虾家系识别的有效工具奠定了基础。     

3种对虾种间RAPD遗传标记

用RAPD技术对虾属中凡纳对虾、日本对虾和中国对虾基因组DNA的特异性遗传标记进行分析，筛选了OPK和OPE两个系列40个引物，有37个引物获得了片段长度在250-2200bp之间且重复性良好的谱带，其中34个引物均可以将1种、2种甚至3种对虾分别区别开来，共获得了264个扩增片段，其中3种对虾特异性片段95个，每个引物分别获得了1-7个大小不等的片段，凡纳对虾获得了28个特异性片段，日本对虾获得了32个特异性片段，中国对虾获得了35个特异性片段。通过Popgnen1.32种群遗传分析软件包计算结果表明：日本与对虾与中国对虾的遗传距离最大，高达0.9096；日本对虾与凡纳对虾的遗传距离次之，为0.8608；凡纳对虾与中国对虾的遗传距离最小，其值为0.6219。根据遗传距离指数，用UPGMA方法进行聚类分析，构建系统树。     

双重PCR同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)

根据Genbank中对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列，设计了两对能分别检测WSSV和IHHNV保守片段基因的特异性引物，而且这两对引物在同一反应体系中可以同时对WSSV和IHHNV的DNA模板进行多重PCR扩增，得到大小分别为110bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的扩增条带。对影响PCR反应的主要因素Mg“浓度和退火温度进行了优化，证明当Mg^2＋浓度为2．0～4．0mmd，退火温度为57～59℃时可获得最佳的扩增和检测效果。特异性试验结果表明，这两对引物检测WSSV和IHHNV具有很好的特异性，对其它对虾常见病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该反应体系最低能检测100pg的WSSV和IHHNV的DNA模板。临床检测表明，所建立的双重PCR方法可以适用于WSSV和IHHNV的同时检测和鉴别。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中使用UNG防遗留污染

设计了一对引物用于PCR检测对虾白斑综合征病毒，PCR扩增过程中用尿嘧啶-DNA糖基酶(UNG)防遗留污染。使用UNG时，该对引物的适宜dUTP和Mg^2 浓度分别为0．4mmol／L和2．0mmol／L；UNG存在时，PCR检测WSSV DNA的最低量为1pg，UNG的使用使PCR的检测灵敏度降低了1个数量级；进行正常PCR扩增前，0．5U UNG可消除至少10ng含dU的WSSV DNA的PCR扩增产物。     

聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑症病毒（WSSV）感染

对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹中检测到WSSV感染的阳性结果表明 :WSSV感染的亲虾有可能是病毒的储主 ,WSSV感染的野生厚蟹有可能是病毒中间宿主或病毒的携带者 ,它们在对虾WSSV病的感染、传播中起了重要的作用     

对虾WSSV和IHHNV多重PCR检测试剂盒的研究与应用

在对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)二温式PCR检测技术前期研究的基础上,将这2种病原的特异性引物与PCR基础反应液一起组装成快速检测试剂盒。通过对试剂盒敏感性、稳定性和保存期等技术指标的测定以及对临床样品的检测试验,该试剂盒对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板均能特异性地扩增出2条与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)的DNA片段,而对其它对虾病原的扩增结果均为阴性;该试剂盒最低能检测到102pg的WSSV DNA和10 pg的IHHNV DNA。对WSSV和IHHNV DNA的检出量分别为102~103pg和10~102pg。     

微卫星三重PCR基因扫描技术在中国明对虾家系标识中的应用

在开发中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物的基础上,利用3对微卫星引物,克隆编号分别为H081、RS0683和RS1101,构建中国明对虾的三重PCR稳定扩增体系。在此基础上,进一步利用荧光标记引物的基因扫描技术(Genescan)对利用精荚移植技术建立的中国明对虾7个半同胞家系和16个全同胞家系进行识别研究。结果表明,该项技术可以准确地把7个半同胞家系的子代个体间、16个全同胞家系的子代个体间以及总的31个全同胞家系的子代个体间区别开,且能准确把这些家系产生的任意子代个体定位到各个家系。该技术可以满足大批量家系材料样本的分析,具有较好的应用价值。[中国水产科学,2007,14(1):59-66]     

应用PCR和RT-PCR技术对4种对虾病毒的检测

探讨了应用PCR和RT－PCR技术对4种主要的对虾病毒进行检测的方法。同时使用该方法检测了对虾天然饵料－－卤虫中的4种对虾病毒。结果显示，含病毒核酸的阳性对照样品分别扩增出了大小为824bp,705bp,260bp和216bp的预期产物，但未能从卤虫样品中检测到此4种病毒的存在。本文报道的病毒检测方法具有快速、灵敏、准确的特点，可以用于进出口贸易中对活体或冰冻对虾，虾苗，对虾饵料等进行相关对虾病毒的检疫，也为制定我国对虾病毒检疫检验规范提供了技术参考。     

黄海蓝点马鲛mtDNA D-loop序列变异分析

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对山东半岛南岸水域的蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)群体(n＝20)的mtDNA D—1oop序列进行扩增，获得了大小约为500bp的扩增产物。PCR产物经纯化后进行序列测定，得到了410bp的核苷酸片段(除去引物及部分端部序列)。用Genedoc软件进行排序比较，在这20个个体中，共检测到54个变异位点，包括2个碱基缺失、1个碱基插入、43个转换位点、7个颠换位点及2个转换与颠换同时存在的位点。运用MEGA软件计算出不同个体间的遗传距离，并据此构建了UPGMA和NJ系统树。用DNASP软件计算出的多态位点数(S)为54、核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)分别为0．0271和11．047。研究结果表明，蓝点马鲛的mtDNA D—1oop基因个体变异程度较大，适合于群体内及群体间不同个体的遗传多样性分析。     

中国对虾5个地理群体的RAPD分析

采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对取自辽东湾、渤海湾、海州湾、乳山湾及海洋岛5个群体的中国对虾共95个个体的遗传多样性进行分析。14个随机引物共检测出103个位点(200～2500bp),各群体的多态位点比例在31．07％～34．95％之间。遗传距离显示中国对虾群体间有一定遗传分化,其中辽东湾和乳山湾群体问的遗传距离最大(0．0742),而辽东湾和渤海湾群体间的遗传距离最小(为0．0243),群体间的遗传分化系数为0．2083。整体来看,中国对虾的遗传变异水平较低,遗传多态度为0．1621。用UPGMA对5个群体进行聚类分析,构建谱系关系图。     

4种紫菜叶状体的ISSR分子标记分析

4种紫菜样品分别为采自青岛海区的野生条斑紫菜（Porphyra yezoensis）、华北半叶紫菜（P.katadai var.hemiphylla）、少精紫菜（P.oligospermatangia）和浙江象山海区人工栽培的坛紫菜（P.haitanensis）.取其10～15 cm叶状体为材料,采用ISSR（Inter-simple sequence repeats）分子标记进行分析.从100个ISSR引物中筛选出22个引物,扩增出清晰、可重复的条带共计247条,其中多态性条带比例达95.5%.根据扩增结果进行的聚类分析显示,条斑紫菜和少精紫菜的亲缘关系最为接近,在聚类图中二者首先聚在一起,接着与坛紫菜相聚,最后与华北半叶紫菜汇聚.本研究还讨论了紫菜属海藻的遗传多样性以及种间的特异性ISSR分子标记.本研究目的在于为紫菜遗传变异、亲缘关系以及分类研究、探索新的分析手段.[中国水产科学,2006,13（3）：371-377]     

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用=Application of ISSR markers in germplasm identification of different color’s Porphyra haitanensis filament strains［刊，中］/谢潮添（集美大学水产学院，厦门361021）,纪德华,陈昌生,徐燕,张元//水产学报，—2007，31(1).-105～111 用ISSR分子标记技术对4个不同色泽坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状体品系（分别为桔黄色，褐绿色，棕红色和紫色）及1个野生型对照丝状体品系（褐红色）进行了遗传分析，共筛选出11条引物，PCR反应得到了129个扩增位点，多态位点比率达88.4％，有效等位基因数为1.6369，期望杂合度为0.3609，Shannon多样性指数为0.5265；根据Nei方法计算了这5个坛紫菜丝状体品系间的遗传相似性系数和遗传距离，结果发现4个不同色泽丝状体间的平均遗传距离为0.5727，它们同野生型对照的平均遗传距离为0.6564，同时应用UPMGA法对它们进行了聚类分析。最后应用引物812扩增的4个多态性位点构建了这5个不同坛紫菜丝状体的DNA指纹图谱，使每一品系都具有独特的DNA指纹，并将其转化成了计算机可以识别的数码指纹，可以方便地应用于坛紫菜丝状体的种质鉴定中。结果表明ISSR分子标记技术可以作为坛紫菜丝状体种质鉴定的有效技术手段，提供快捷、准确的鉴定结果。图3表5参24 关键词：坛紫菜; ISSR标记; 遗传分析; 种质鉴定 E-mail: cschen@jmu.edu.cn     

七里海中华绒螯蟹遗传多样性的RAPD和ISSR分析

利用RAPD-PCR及ISSR-PCR两种分子标记技术,分析了七里海中华绒螯蟹第6代繁育群体的遗传多样性。用10个多态性高的RAPD引物对24个七里海中华绒螯蟹样本个体进行扩增,共检测出107个不同的扩增位点,扩增片段大小为300~2300bp。其中多态位点总数为66个,平均多态位点比例为61.32%,群体内香农-维纳多样性值为0.1714。用8个多态性高的ISSR引物对24个个体共检测到106个位点,扩增片段为200~1500bp。其中多态性位点79个,平均多态位点百分率为74.53%,群体内香农-维纳多样性值为0.1778。结果显示,该群体的多态位点比例和香农-维纳多样性值均较大,说明其有较丰富的遗传多样性,同时也说明RAPD和ISSR技术用于七里海中华绒螯蟹核基因组的遗传多样性分析,具有较高的检出率和灵敏度。     

松江鲈群体遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对辽宁丹东和河北秦皇岛2个地区松江鲈(Trachidermus fasciatus)群体的遗传多样性进行了分析。结果显示:77个ISSR引物中有4个引物能扩增出清晰条带,4个引物对两个群体各24个样品扩增出27个位点。松江鲈丹东和秦皇岛两群体的多态位点比率均为44.44%,Shannon′s指数分别为0.2728、0.2836。Shannon′s指数和AMOVA分析均显示松江鲈的遗传变异主要来自于群体内个体间。松江鲈UPGMA系统树没有依据群体分别聚类,无明显遗传趋异。两个松江鲈野生群体的平均杂合度和多态位点与处于濒危状态的江豚类似,多态性位点比例低于濒危状态的平胸龟和长江刀鲚。结果表明:两个地区松江鲈群体的遗传多样性处于较低水平,遗传变异相对贫乏;松江鲈丹东和秦皇岛两个群体间无明显的遗传分化,亲缘关系较近。     

~(60)Co-γ射线对长毛明对虾诱变后子代幼体遗传变异的RAPD分析

本文首次使用60Co-γ射线对长毛明对虾进行诱变,将性腺成熟的长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)分为四组进行不同剂量的60Co-γ射线照射,采用RAPD技术对诱变子代的无节幼体基因组DNA多态性进行了检测。遗传相似系数用Nei的计算方法进行计算,遗传距离则用Lynch的计算方法进行计算。从20个随机寡核苷酸引物共检测154个位点,其中多态位点103个,占66.9%。单个引物获得的标记为4~11个,平均7.7个,分子量在100~2500bp之间。计算得到的遗传相似系数变化范围在0.7995~0.8696之间,相应的遗传距离变化范围则在0.1397~0.2288之间。实验表明:诱变子代与正常对照组相比,遗传多样性水平较高,诱变产生了较为显著的变异。     

雌核发育鲢RAPD指纹和蛋白质电泳研究

用２３个随机引物对雌核发育鲢子一代（普通鲢作对照）进行了ＲＡＰＤ—ＰＣＲ反应，在２３个引物中除一个引物无扩增产物外，其它均可得到１～１０条ＤＮＡ带，平均每个引物产生５３８条带。其中７个引物产生多态现象，占总引物的３１４％。多态座位达１３６８％。用Ｓｈａｎｎｏｎ指数对ＲＡＰＤ数据进行遗传多样性（Ｈｏ）分析，得出所研究样本的Ｈｏ为０１７５。用血清酯酶和血清蛋白电泳作对比时没有发现在蛋白质水平的多态现象，说明ＲＡＰＤ技术是一种比较灵敏实用的ＤＮＡ多态检测方法。以ＲＡＰＤ所得数据进行了雌核发育鲢子代和普通鲢个体间的遗传相似性与遗传距离分析，为鲢选育提供了依据。     

3种市售养殖对虾白斑综合征病毒(WSSV)的核酸探针检测

对虾白斑综合征病毒是对虾养殖业危害最为严重的病毒, 每年给对虾养殖造成很大经济损失, 已成为对虾养殖业可持续发展的严重障碍。在过去的十几年中, 人们采取各种方法防止白斑综合征病毒的传播。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis )、凡纳滨对虾( Litopenae vannamei)、日本囊对虾(Marsup enaeus jap onicus)是我国主要的对虾养殖品种, 也是白斑综合征病毒的敏感宿主。按照煮沸- 乙醇沉淀法快速、简便提取市售30 只中国明对虾、28只凡纳滨对虾、29只日本囊对虾DNA, 然后用地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交检测白斑综合征病毒,从而了解市场中养殖对虾携带白斑综合征病毒的情况。检测结果显示, 所有样品均未感染白斑综合征病毒, 说明目前白斑综合征病毒在一定程度上得到了有效控制。     

中国明对虾种质资源研究现状与保护策略

中国明对虾主要分布在黄、渤海水域，是我国重要的渔业资源之一。由于忽视对中国明对虾种群自然状态下遗传多样性的监测，缺乏对种质资源进行长期的、有效的管理，造成黄、渤海野生群体的遗传多样性下降。目前，随着对种质资源的研究越来越受到人们的关注，中国明对虾种质资源以及种群遗传学已成为研究热点，种群保护也已提到议事日程。这些研究工作的开展将为中国明对虾良种选育提供理论依据，相信随着研究工作的继续深入，人们会更好、更有效地利用对虾资源。