锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学上,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现的特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB)后,盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球形病毒,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学上,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现的特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB)后,盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球形病毒,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学上,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现的特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB)后,盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球形病毒,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

锦鲤昏睡病(KSD)的实验室诊断分析(下)

正4.寄生虫检测和细菌分离结果经制片和显微观察,所检锦鲤病鱼组织均未观察到寄生虫。将病鱼脑、肝胰脏、脾、肾组织病料接种于LB平板上,28℃培养24小时,未见细菌生长。5.分子生物学检测结果采用相关检测方法对2018年7月末采集的患病锦鲤鳃组织样品进行SVCV、KHV、CyHV-II、CEV分子生物学检测,结果显示,发病锦鲤鳃组织样品均未扩增出SVCV、KHV、CyHV-II特异性片段(未列出);CEV TaqMan荧光定量检测方法结果如图4A,显示该样品Ct值小于35,CEV为阳性。     

北京市在全国首次确诊鲤浮肿病

正2013年以来,北京地区多次发生锦鲤和鲤鱼不明病因大量死亡。病鱼临床症状很像是锦鲤疱疹病毒病(KHV):昏睡、眼球凹陷、烂鳃、皮肤损害,但实验室检测却显示不是KHV感染。经过进一步研究,相关人员从病鱼内脏切片中观察到痘病毒样颗粒,用PCR和Real-time PCR方法检测到鲤鱼浮肿病毒的基因片段,和已知鲤鱼浮肿病毒(CEV)的相应片段符合率达100%,从而确定病原是鲤痘病毒。这是北京市水产     

鲤科疱疹病毒Ⅱ型射阳株的分离与鉴定

对患"鳃出血"病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)病灶组织进行分离,并通过回归感染试验、细胞分离鉴定、电镜观察以及PCR几种方法结合来鉴定。结果显示:健康异育银鲫注射组织滤液5 d后开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为80%,对照组没有死亡。对患病鱼内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察发现组织内有大量的病毒颗粒,成熟的病毒粒子直径大小170~200 nm,与疱疹病毒Ⅱ型病毒粒子相符。滤液经疱疹病毒Ⅱ型特异性的PCR检测,获得阳性目的片段,同时将无菌处理的病样滤液接种胖头鲤细胞(FHM),培养1 d后出现明显的细胞病变(CPE),单层细胞网状收缩,坏死细胞聚集。收集细胞培养液,进行病毒特异性的PCR检测,并检测到436 bp的阳性片段。结果表明:从江苏射阳某"鳃出血"病异育银鲫养殖鱼塘分离到的病毒为疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)病毒。     

一株鲈鲤源鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及其病理观察

2016年4月,四川某鲈鲤(Percocypris pingi)养殖场流行一种以鳃、鱼鳔和内脏器官出血为临床特征的传染病。组织病理学观察发现,患病鲈鲤全身多组织器官均发生明显的病理损伤,尤其是肝、脾、肾、鳃和肠表现为明显的出血、变性、坏死以及炎症细胞浸润。取病鱼组织匀浆滤液接种鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC),盲传3代出现典型的细胞病变(cytopathic effects, CPE)。将自然发病鱼组织匀浆滤液和细胞培养病毒液分别接种健康鲈鲤,实验鱼出现与自然发病鱼相同的症状,死亡率分别为60%和50%,而对照组未见异常。对经分离毒株ZLP160415感染出现CPE的EPC细胞制备超薄切片进行电镜观察,发现病毒呈弹状,长90～150 nm,宽40～60 nm;对自然发病鱼、人工感染发病鱼内脏组织和细胞培养病毒液进行鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,SVCV)的RT-PCR检测,均扩增出目的条带。基于SVCV糖蛋白基因进行系统发育分析,结果显示分离毒株(ZLP160415)属于Ia型。结合本次疾病的流行病学与病理损伤特点、病毒分离鉴定、人工感染试验结果和透射电镜检查,确定此次流行病的病原为SVCV。     

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法-单克隆抗体技术研究进展

正一、简介锦鲤疱疹病毒病(KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的一种非常严重的、法定的传染病。它通过锦鲤、鲤鱼的贸易传播。该病死亡率高达80%~100%。被感染的鱼常见的临床症状为有白色斑,眼凹陷,脾脏和肾脏肿大,鳃部坏死。Cy HV-3在温度15~25℃易感染,可从死鱼的肾、鳃、脾、小肠、肝脏和大脑中分离,其基因组包含约29.5万个碱基对(kb),编码156个开放性阅读框。目前还没有有效的药物和疫苗可以抑制锦鲤疱疹     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒.应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树.结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸；预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404；疏水性大于亲水性；信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸)；有4个跨膜区；抗原表位预测显示抗原性良好；结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和11个磷酸化位点；系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支.     

池塘精养日本锦鲤成鱼试验

日本锦鲤是一种集观赏、垂钓、美食于一体的较大型鱼类 ,素有“水中瑰宝”之美誉。其体色艳丽、游姿潇洒、斑纹华丽 ,且易于饲养 ,越来越受人们的青睐。 2 0 0 1年 3月 16日至 11月 10日我们进行了日本锦鲤成鱼的池塘集约化养殖试验 ,取得较好的效益 ,现将试验总结如下。1　材料与方法1 1　池塘条件 :试验池为洛阳市郊区面积为 2 5亩的长方形池塘。池埂为砖混结构 ,池深为 2m以上 (可保持水位 1 5m以上 ) ,水源采用无污染的地下水 ,且注水、排水方便。池中配备 1 5的叶轮式增氧机一台。1 2　鱼种放养 :2 0 0 1年 3月 16日从洛阳市水产科…     

锦鲤的疾病防治

锦鲤属鲤形目、鲤科、鲤亚科、鲤属,现已有100多个品种。由于锦鲤体格健壮,游姿高雅,体型优美,色彩艳丽,斑纹灿烂,适应能力强,目前在我国不论是公园的水塘,还是家庭的鱼缸,到处都可以见到锦鲤矫健而美丽的身影。在养殖过程中,锦鲤的疾病和大多数鱼类一样,由于发现疾病症状较晚而难以治     

A comparison of growth, survival rate and number of marketable koi carp produced under different management regimes in earthen ponds and concrete tanks

To compare the growth performance of koi carp, Cyprinus carpio var. koi, produced in concrete tanks (2.13 × 0.91 × 1.22 m; capacity: 2,000 l each) and earthen ponds (9.1 × 6.10 × 1.07 m; capacity: 59650 l each), fish larvae (stocking size: 0.12 ± 0.008 g) were cultured for 11 weeks and individual weight gain, survival rate and number of marketable fish produced were compared among four management regimes for each culture system: (1) live zooplankton fed to fish larvae in ponds (PLF) and tanks (TLF); (2) application of poultry manure in ponds (PPM) and tanks (TPM); (3) application of cow manure in ponds (PCD) and tanks (TCD); and (4) a control treatment for ponds (PC) and tanks (TC), where a commercial feed was applied. There were three replicates for each treatment. Weight gain of koi carp was highest in the PLF treatment, followed in decreasing order by TLF, PPM, PCD, TPM, TCD, PC and TC treatments (P < 0.05). There was a significant difference in the survival of koi carp among the treatments, ranging from 67.83% in TC to 95.50% in PLF. The number of marketable fish produced was highest in the PLF treatment, followed in decreasing order by TLF, PPM and PCD treatments. However, none of the fish produced in the TPM, TCD, PC and TC treatments attained marketable size. Significantly higher (P < 0.05) values of pH and dissolved oxygen (for water samples collected weekly at 9 A.M.) were obtained in the live food and control treatments (for both tanks and ponds), compared to the manured treatments. The concentration of total alkalinity, BOD, PO₄-P, NO₃-N and specific conductivity were significantly higher (P < 0.05) in PPM and PCD, compared to other treatments. NO₂-N and NH₄-N values were significantly higher (P < 0.05) in TPM and TCD, than other treatments. The results suggest that introduction of live zooplankton into culture units result in higher growth of koi carp larvae compared to manure based systems. Earthen ponds appeared to be better alternative to concrete tanks for manure application through maintenance of better water quality due to their higher assimilatory capacity and greater abundance of plankton which resulted in better growth of cultured fish.     

Morphogenesis of koi herpesvirus observed by electron microscopy

Koi herpesvirus (KHV or cyprinid herpesvirus 3) was inoculated onto three fish cell lines derived from carp, Cyprinus carpio L., and the process of virion formation observed with electron microscopy. Essentially, similar features of virus particles were observed in all three cell lines. The nucleus of infected cells was characterized by margination of chromatin and often contained many capsids of about 110 nm in diameter with varying morphology. The morphological variation of the capsids was very similar to that of mammalian herpesviruses. Some capsids protruded from the inner nuclear membrane, and others, with envelopes, were located in the perinuclear space between the inner and outer nuclear membrane, suggesting budding of capsids at the inner nuclear membrane. Naked capsids and envelopment of capsids by budding into vesicles were also observed in the cytoplasm. Mature, enveloped virions 170-200 nm in diameter were seen in cytoplasmic vesicles or outside the cell. These observations suggest KHV virions mature through a complex morphological pathway including two distinct envelopments, which have been found only in herpesviruses. These observations support the inclusion of KHV in the family Herpesviridae.     

锦鲤疱疹病毒组织灭活疫苗研制初探

本研究的目的是制备针对锦鲤疱疹病毒的组织浆灭活疫苗,用来控制目前集约化养殖鲤鱼大面积暴发的锦鲤疱疹病毒。利用现场采集的病死鱼内脏,匀浆后腹腔注射进行攻毒试验,采集攻毒后病死鱼的内脏匀浆后,加入0.5%甲醛制备组织浆灭活疫苗。确定所制疫苗无杂菌污染后,在实验室内对6组实验鱼采用不同的接种方法进行疫苗接种,同时设立阴性对照组。实验结果表明,所得疫苗可以在一定程度上降低死亡率,但不能100%的控制发病,具体原因有待进一步探讨。     

Antiviral activities of Clinacanthus nutans (Burm.f.) Lindau extract against Cyprinid herpesvirus 3 in koi (Cyprinus carpio koi)

Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV‐3) or koi herpesvirus (KHV) is a virulent viral infection in common carp and koi. The disease has caused global epizootic and economic loss in fish aquaculture and in the wild. Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau is a well‐known medicinal plant used in Thai traditional medicine. Virucidal effects of the plant extract against human herpes simplex virus have been reported. In this study, C. nutans crude extract was tested for antiviral activities against CyHV‐3 in koi carp. Results showed effective antiviral activity against CyHV‐3 pre‐ and post‐infection. The 50% lethal concentration (LC₅₀) of extract was higher than 5 mg/ml. The 50% effective dose (ED₅₀) was 0.99 mg/ml, 0.78 mg/ml, 0.75 mg/ml and 0.71 mg/ml at 1, 2, 3 and 4 hr pre‐infection, respectively. The ED₅₀ from post‐infection tests was 2.05 mg/ml and 2.34 mg/ml at 0 and 24 hr, respectively. These results demonstrated that crude extract expressed antiviral activity against CyHV‐3 and can be applied as a therapeutic agent in common carp and koi aquaculture.     

池塘小体积网箱养殖日本锦鲤试验

2003年,我们利用一口面积为2400m^2的池塘进行了池塘小体积网箱养殖日本锦鲤试验,在4个长2m、宽2m、高1m的小体积网箱中,按一定的密度投放平均规格为70—80g／尾的日本锦鲤鱼种,经过六个多月的饲养,每m^3平均净产日本锦鲤83．4kg,现将试验总结如下。