抗大鲵虹彩病毒MCP COE蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗大鲵虹彩病毒(CGSIV)MCP COE蛋白的单克隆抗体,并对其基本特性进行鉴定及开展初步应用。用纯化的重组CGSIV MCP COE蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株。采用间接ELISA法、免疫印迹法和单克隆抗体亚型检测试剂盒等鉴定单抗的稳定性、特异性和亚型;采用腹水诱生法制备单抗腹水,饱和硫酸铵法纯化腹水单抗;间接ELISA法分别测定单抗杂交瘤细胞上清液和腹水单抗的效价;利用间接免疫荧光法观察CGSIV的增殖。结果显示,细胞融合克隆率为98.68%,阳性率为20.52%,得到1株能够稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,命名为1M6。单克隆抗体的亚型属于Ig G2b,κ链;免疫印迹法和间接ELISA法测定结果显示,单抗具有很好的特异性;杂交瘤细胞株培养上清液的效价为1∶1600,腹水单抗效价为1∶2×106,亲和常数为2×105。间接免疫荧光显示CGSIV感染EPC细胞24 h后在宿主细胞质中可以观察到成熟的病毒粒子形成的包涵体,而且在宿主细胞核内也能发现病毒粒子。抗CGSIV MCP COE蛋白单克隆抗体的成功制备为CGSIV免疫学检测方法的建立和其他相关研究的开展奠定了基础。     

传染性胰腺坏死病毒VP2COE蛋白单克隆抗体的制备及与初步应用

为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。     

抗传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5.抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为K链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应.选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子.本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础.     

环丙沙星单克隆抗体的制备及其特性分析

以人工合成的牛血清白蛋白环丙沙星抗原(CPFX-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CPFX - BSA的McAb,获得1株稳定分泌针对CPFX药物的单克隆抗体细胞株5G4,腹水效价达1.28×10-6；SDS - PAGE电泳分析CPFX McAb 5C4蛋白重链和轻链的分子量约为50KD和25KD；抗...     

血卵涡鞭虫单克隆抗体的制备与初步应用

用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B₂、3G₄、4G₇),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10^-4和8.00×10^-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。结果表明,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,可用于血卵涡鞭虫的早期临床诊断。     

罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用

罗氏沼虾肌肉白浊病（whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii）是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病，发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状，死亡率高达60％以上，作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachiium rosenbergii Nodavirus，MrNV）的基础上，用MrNV免疫BALB／c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2／0鼠骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA筛选阳性孔，经有限稀释法克隆，得到12株能特异分泌抗MrNV的单兜隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞。注射小鼠，制备腹水单克隆抗体，ELISA效价为1：10^5～10^6。亚型鉴定结果表明，有6株单抗为IgG1型，4株甲抗为IgG2a型，2株单抗为IgG2b型。12株单抗与对虾白斑综合征病毒（WSSV）和桃拉综合征病毒（TSV）均无交叉反应：挑选效价高的腹水单抗2B5，建立了检测罗氏沼虾诺达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定（TAS—ELISA）法，该方法检测灵敏度达0．98ng左右。Wesrtem blot分析表明，2B5能与MrNV 43kD的外膜蛋白特异性结合。     

嗜水气单胞菌气溶素单克隆抗体的制备及初步应用

以1％福尔马林灭活的嗜水气单胞菌纯化的气溶素免疫8周龄的BALB／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，经间接ELISA筛选，获得1株稳定分泌气溶素单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2D3。腹水单抗ELISA效价为1：16，384（1：2^14），其能特异性抑制气溶素的溶血活性并且腹水单抗有中和特性，抑制效价和中和效价分别为1：128（1：2^7）和1：128（1：2^7）。以此单抗建立了检测嗜水气单胞菌气溶素的问接ELISA方法，对临床分离的50株嗜水气单胞菌培养上清检测，有48株呈阳性反应。     

锯缘青蟹凝集素的提取及单克隆抗体制备

凝集素是无脊椎动物非特异性免疫系统的重要组成成份，可凝集外来病原菌、进行非己识别、调理和介导血细胞吞噬。开展了锯缘青蟹血清凝集素的提取、单克隆抗体制备及凝集素定位研究，以N-乙酰基葡萄糖胺（N-Acetyl-D-glucosamine，GlcNac）为配基制备了Sepharose 4B亲和层析柱，可选择性结合青蟹血清凝集素；青蟹血清通过亲和层析柱后，以0.45 mol/L NaCl洗脱，得到有较高凝集活性的单一洗脱峰，该洗脱峰凝集素比活为血清凝集活性的32.6倍，SDSPAGE显示存在87 ku和79 ku主要蛋白成分；以纯化青蟹凝集素免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、单抗筛选获得BF82等7株可稳定分泌抗凝集素单抗的小鼠杂交瘤细胞株，单抗腹水的ELISA效价为1∶10⁴～1∶10⁵；单抗可特异性抑制青蟹凝集素的血凝，血凝抑制效价为1∶32～1∶64，亚型鉴定表明7株单抗均为IgG1型，免疫印迹表明单抗可特异性结合87 ku、79 ku蛋白；采用凝集素单抗间接免疫荧光法进行了青蟹血淋巴细胞染色，结果显示凝集素主要分布于颗粒细胞的细胞质颗粒和透明细胞的细胞膜上。     

欧洲鳗黏膜免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了8个分泌抗欧洲鳗（Anguilla anguilla）黏膜免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株，并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。结果显示，8株单抗中IgM有2株，IgG，和IgG2。各有3株；所有单抗均与欧洲鳗黏膜免疫球蛋白呈ELISA反应阳性，腹水抗体滴度为在10^4～10^6之间。进一步实验证实，这些单抗与供试的10种水产动物常见病原菌均无交叉反应；其中3株单抗与欧洲鳗血清IgM有不同程度的交叉反应；4株单抗与黏膜免疫球蛋白有交叉反应，其中2株单抗交叉反应较弱。以上结果提示，欧洲鳗黏膜免疫球蛋白和血清IgM之间既有各自独特的抗原决定簇，又有共同抗原位点，证实欧洲鳗黏膜抗体在抗原性方面有别于血清IgM。成功制备的这8株单抗可用于鳗黏膜免疫球蛋白的检测及其结构和功能分析，为欧洲鳗黏膜免疫的进一步研究提供工具。[中国水产科学，2008，15（3）：511-515]     

鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。     

In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel)

Mouse monoclonal antibodies (MAbs) were produced by using yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) as an immunogen, isolated from infected yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), and propagated in GB cells. In enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), 43 hybridoma clones secreting MAbs strongly reacted with the purified virus. Ten of them showed a higher neutralization index (NI) value between 6.5 and 4.5 (log₁₀ NI) than the other 33 MAbs against YGNNV infection in cell culture. All 10 MAbs belonged to the IgG isotype with a κ light chain and recognized the 42 kDa coat protein of YGNNV by Western blot analysis. Immunohistochemical results demonstrated that the viral signals co-located with pathological lesions observed in retina, brain and spinal cord. These results indicate that the MAbs are useful for confirmative diagnosis of YGNNV infection.     

Generation of mouse monoclonal antibodies specific to tilapia immunoglobulin using fish immunoglobulin/BSA complex for monitoring of the immune response in Nile tilapia Oreochromis niloticus

The simple immunoprecipitation method was used to isolate tilapia immunoglobulin (Ig) for immunization in order to produce monoclonal antibodies (MAbs) specific to tilapia Ig. First, the tilapia antiserum against bovine serum albumin (BSA) was prepared by peritoneal injection of BSA into tilapia, and the tilapia anti‐BSA antiserum was used to precipitate BSA to form the Ig/BSA immune complex. The Ig/BSA immune complex was then injected into Swiss mice for hybridoma production. After fusion, three hybridoma clones producing MAbs specific to the tilapia antibody were selected by dot blot and Western blot. All MAbs (101A, 59G, and 11A) were bound specifically to the heavy chain of immunoglobulin M (IgM). The MAbs 101A and 59G demonstrated twofold higher affinity than MAb 11A and the commercialized antibody. However, MAbs 11A could also bind to the heavy chain of IgM in Asian seabass, Lates calcarifer, as well. These MAbs can be used to monitor the immune responses of individual fish by indirect ELISA upon exposure to various antigens.     

应用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍致病病原—创伤弧菌的研究

以皱纹盘鲍脓足病致病病原－ － 创伤弧菌为抗原,制备兔抗血清,抗体纯化后以辣根过氧化物酶标记,建立检测创伤弧菌的双抗夹心ＥＬＩＳＡ 检测法。结果表明,双抗夹心ＥＬＩＳＡ 法有较高的灵敏度,可检出含菌１０４ 个／ｍｌ 的菌悬液。与创伤弧菌对照菌株有明显的阳性反应不与副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、河流弧菌等８ 株对照菌株产生影响检测结果的交叉反应。应用该法检测３０ 份病鲍样品,阳性检出率为６６ ．７ ％ 。     

Characterization of a monoclonal antibody against the 47- kDa antigen of Cryptobia salmositica Katz and its use in an antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of parasite antigen in infected rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum)

A monoclonal antibody (designated MAb-007) was produced against the pathogenic haemoflagellate Cryptobia salmositica Katz. This IgG3 antibody recognized the 47-kDa antigenic polypeptide of C. salmositica (SDS-PAGE and Western immuno-blotting). The antibody did not agglutinate live parasites, and there was no change in the staining intensity of the 47-kDa band on Western immunoblots after immunoabsorption of MAb-007 with live intact parasites. The 47-kDa antigen recognized by MAb-007 was localized in the cytoplasm of the parasite (immunogold labelling and electron microscopy). The monoclonal antibody cross- reacted with the 47-kDa polypeptides of C. bullocki Srrout and C. catostomi Bower & Woo. It was used in an antigen-capture ELISA for the detection of parasite antigen in the plasma of rainbow trout inoculated with the parasite, or with an attenuated vaccine strain of C. salmositica. All pre-infection plasma were negative while all infected fish with detectable parasitaemias were positive for antigen at 1–9 weeks after infection. Parasite antigen was even detected in vaccinated fish that were negative for parasites using the wet mount microscopic technique. The antigen-capture ELISA detected C, salmositica antigen in whole cell lysate preparations at concentrations as low as 0.5 μg ml^-1. Fifty microlitres of fish plasma was required in the antigen-capture ELISA, and the use of a plate reader and 96-well plates facilitated rapid analysis of a large number of plasma samples. The sensitivity of the assay makes it a potentially useful tool for detection of Cryptobia infections.     

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）为抗原免疫Balb/c小鼠，而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合，以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞，阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分，且多个荧光信号相连呈现链圈状，有限稀释 法克隆阳性杂交瘤细胞，三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株（1A8、1D7、2B6、2D11）。应用Western-blotting法分析单抗识别蛋白的分子量，结果显示，单抗1D7 和2B6均能特异性结合一条分子量116 kD病毒多肽；应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇，结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围，且背景清洁，无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116 kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白，且具有线性抗原决定簇。     

A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serological detection of antibodies against the European hog cholera virus]

An ELISA for the detection of antibodies against hog cholera virus (HCV) was developed. The HCV-specific glycoprotein gp53 served as diagnostic antigen after immobilization using a monoclonal capture antibody. Due to the higher affinity of HCV-specific antibodies to the viral gp53, sera cross reacting with bovine viral diarrhea (BVD) virus were discriminated by the slope of the titration curves.