团头鲂NK-lysin基因鉴定和表达分析

为研究抗菌肽NK-LYSIN在团头鲂免疫系统中的可能功能,本实验从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb),通过PCR扩增并测序验证其ORF序列。通过荧光定量PCR检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达,并构建其原核表达体系。结果显示,团头鲂nkla和nklb分别编码122和136个氨基酸,NKLA和NKLB均属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员,各含有6个高度保守的半胱氨酸及1个Sap B结构域。在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,在肌肉和血液中表达量极低;而nklb则在肠中表达量较高,在头肾中表达量较低,在其他组织均有表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示它们可能存在功能上的分化。经嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla与nklb表达变化模式相似,头肾中,表达量在4 h时显著下降;肝脏中,表达量在4 h达到最高,而后回落到正常水平;在脾脏和肠中4 h时开始下降,72 h时达到峰值,暗示NK-lysin可能在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥重要作用。另外,本实验对nkla和nklb进行了原核表达,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

鳜IRAK4基因的克隆、组织表达及病毒感染后表达分析

为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用SMART-RACE技术克隆得到CDS全长为1389 bp的c DNA(命名为Sc IRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了Sc IRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中Sc IRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中Sc IRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明Sc IRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示Sc IRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。     

仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析

表皮生长因子受体(EGFR)是多种细胞因子的受体,在细胞增殖、迁移及分化中具有重要的作用。应用RACE法首次从仿刺参体腔细胞中克隆出EGFR基因的全长cDNA序列。该cDNA全长3 826 bp,包括821 bp的5’-UTR,281 bp的3’-UTR,开放阅读框2 724 bp,编码907个氨基酸。推导的氨基酸序列55-184aa和365-487aa符合EGFR基因所具有的L1和L2受体结构域,在203-344aa和503-823aa含有EGFR家族特征区域CR1和CR2半胱氨酸富集区,并同为跨膜糖蛋白,在结构上具有一致性。经BlastP与GenBank已知物种氨基酸序列进行同源性比对,仿刺参EGFR基因氨基酸序列与果蝇EGFR相似性为49%,同源性为34%,与斑马鱼EGFR相似性为47%,同源性为34%,与淡水椎实螺EGFR相似性为49%,同源性为31%。据此推断,仿刺参EGFR基因属于EGFR家族成员。利用Real-time PCR技术检测了该基因在仿刺参各组织中的表达,结果显示在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中EGFR均有表达,且体腔细胞和表皮表达量较高。结果表明,该基因可能在仿刺参组织发育和再生过程中起到重要的调控作用。     

草鱼Stefin克隆表达、纯化及活性特征鉴定

文章克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Stefin c DNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly(3、4)残基及QXVXG(45~49)序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)Stefin A1一致性最高,为47.5%。进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)、southern platyfish(Xiphophorus maculatus)、Colisa chuna(Trichogaster chuna)、lamprologini(Neolamprologus brichard)、elephant shark(Callorhinchus milii)及bicolor damselfish(Stegastes partitus)Stefin A聚为一类。将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E.coli BL21,以1 mol·L-1IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 k D的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28%。以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) CD59基因的原核表达与功能探究

本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式.结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高.对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59.该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好.Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达.对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功.选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白pET-32a-CD59的抑菌活性.研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性.本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础.     

草鱼AdipoR1-B基因克隆、组织分布及其表达的营养调控

为探讨Adipo R1-B在鱼类糖类和脂质代谢中的作用,本实验采用RACE方法获得了草鱼Adipo R1-B的全长c DNA序列(登录号:KP733846),利用生物信息学技术对该基因及其所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时定量PCR技术,检测了Adipo R1-B在19个不同组织中的表达特性以及高糖(45%)、高脂(8%)和高糖高脂饲喂对草鱼肝脏中该基因表达的影响。结果显示,草鱼Adipo R1-B c DNA全长2186 bp,其中开放读码框为1122 bp,编码373个氨基酸;跨膜结构分析表明草鱼Adipo R1-B为典型的7次跨膜蛋白;同源性分析结果显示,草鱼Adipo R1-B与其他物种的Adipo R1-B高度同源(氨基酸相似度78%以上),并与斑马鱼Adipo R1-B的进化关系最近;组织分布结果显示,Adipo R1-B在草鱼肝脏中表达量最高,中枢神经系统和红肌次之;此外,高脂和高糖高脂饲喂均能够显著提高草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平。因此,草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平受到日粮中脂类水平的调控,推测该受体可能在调节鱼类脂质代谢中发挥重要作用。     

中华绒螯蟹FAD6-b基因的全长克隆及原核表达分析

根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。     

草鱼生长激素cDNA基因的克隆及序列分析

通过反转录PCR技术，从草鱼脑垂体的总RNA中获得一特异cDNA片段，经克隆后测序，结果表明，该片段长633bp，与报道的草鱼生长激素基因相比，有10个碱基的差异，而推导的蛋白质仅1个氨基酸残基的差异，推测为草鱼生长激素cDNA基因。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

草鱼血红蛋白通过诱导头肾巨噬细胞表达的炎症因子激活免疫反应

为了探究鱼类体内过量游离血红蛋白对鱼体的影响,本实验以草鱼为研究对象,通过体内注射血红蛋白模拟体内出血,探究血红蛋白对组织和组织中巨噬细胞的免疫调控作用。体内注射血红蛋白的实验结果显示,血红蛋白的刺激导致头肾和中肾组织中出现明显的血红蛋白沉淀,同时提高了鱼体血清中的抗氧化相关酶活性,促进了头肾组织中炎症因子基因TNF-α、IL-1β和IL-10的mRNA表达水平。普鲁士蓝和间接免疫荧光实验结果显示,头肾巨噬细胞对血红蛋白表现出了吞噬活性。荧光定量PCR检测结果显示,血红蛋白的刺激显著激活了头肾巨噬细胞中CD68、CD86、CSF和MHC-Ⅱ的mRNA表达水平。进一步的细胞因子检测结果显示,血红蛋白刺激12 h后,头肾巨噬细胞中的炎症因子基因(TNF-α、IL-1β和IL-4)、趋化因子基因(CCL20和CCL4)、IFN-α和TLR4的mRNA表达水平被显著上调表达。研究表明,草鱼头肾巨噬细胞对血红蛋白具有吞噬能力,同时血红蛋白也激活了巨噬细胞中多种细胞因子的表达。本研究结果首次阐述了草鱼血红蛋白与巨噬细胞的相互作用关系,丰富了鱼类血液基础免疫学理论,同时也为鱼类健康养殖提供了新的参考...     

草鱼体内溶血对肝脏氧化损伤的机制

以草鱼为研究对象,系统研究了溶血对肝脏的损伤机制,以揭示血红蛋白对机体的损伤作用。首先在体内注射血红蛋白,通过苏木精-伊红染色(H.E)发现注射血红蛋白组的肝脏组织中坏死细胞明显增多,普鲁士蓝染色揭示肝脏中存在大量的铁沉积,进一步的实时定量PCR (qRT-PCR)检测结果显示,注射的血红蛋白激活了铁代谢相关基因的表达。为进一步探究体内出血对肝脏的影响,实验通过体内注射苯肼模拟体内出血,H.E和普鲁士蓝染色结果表明,大量的溶血导致肝脏细胞坏死和铁的沉积增加,通过检测肝脏中血红蛋白和铁含量发现,苯肼组中,肝脏组织血红蛋白和铁含量随着时间延长而显著增加,而铁含量的增加同时激活了肝脏组织中铁代谢相关基因的表达。其次,实验检测了注射苯肼后肝脏组织中炎症因子的表达情况,qRT-PCR结果显示,高剂量的血红蛋白激活了多种细胞因子的基因表达,如促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6,抑炎因子IL-10以及趋化因子IL-4和IL-8等。为进一步探究高氧化活性的血红蛋白对肝脏组织的氧化损伤作用,实验检测了肝脏组织中丙二醛(MDA)、脂质过氧化物(LPO)以及β-半乳糖苷酶的含量,检测结果表明,鱼体内的出血显著增加了肝脏氧化损伤作用,同时,qRT-PCR和酶活性检测结果揭示,血红蛋白的氧化损伤作用促进了肝脏组织细胞凋亡的发生。最后,实验检测了肝脏组织中抗氧化酶的表达情况,结果显示,体内的出血显著激活了肝脏组织中的抗氧化系统。研究表明,鱼体内大量出血释放的高氧化活性的血红蛋白显著激活了肝脏组织炎症和氧化损伤的发生,促进了肝脏组织中的细胞凋亡,同时也激活了机体内的抗氧化系统。     

鲤和草鱼IL17受体基因家族的全基因组识别、起源进化及表达分析

为了研究鲤科鱼类最具代表性的二个物种—鲤和草鱼IL17受体基因家族的起源进化,实验采用比较基因组学和生物信息学的方法,分别在鲤和草鱼基因组数据库进行序列比对和注释,然后对得到的基因进行结构域和系统发育学分析,最后在12个不同组织中进行基因表达分析研究。结果显示,在鲤和草鱼中分别注释得到9个和5个IL17受体基因家族成员。系统发育分析显示,该基因家族不存在鱼类特有的基因,在硬骨鱼类中具有一定的保守性。比较基因组学结果显示,与四足动物相比,大多数硬骨鱼类中IL17受体基因没有明显增多。鲤与草鱼等其他硬骨鱼类相比,除IL17RB以外,其余IL17受体基因家族成员均加倍。不同组织的表达分析结果显示全基因组复制后不同基因拷贝的功能发生了分化。研究表明,虽然硬骨鱼经历第三轮全基因组复制,但是由于复制发生时间久远,大多数基因已经发生改变或退化,进而在基因组中丢失。而鲤第四轮基因组复制时间发生在820万年前,复制发生时间较近,故复制后的基因基本得以保留。但是对于一些具有特殊功能的高度保守基因(例如IL17RB),也会发生在极短时间内出现丢失现象。鲤和草鱼健康组织的表达谱分析结果同样表明,鲤IL17受体基因的不同拷贝之间已经发生了快速进化及亚功能化,并且这种现象在鲤四倍体基因组中普遍存在。     

草鱼TLR9基因全长cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术,从草鱼鳃组织中克隆了Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因的cDNA全长。序列分析表明,草鱼TLR9 cDNA全长3 468 bp,编码1 058个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、16个富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat,LRR)、1个跨膜区和1个TIR结构域(Toll/IL-1 receptor)。该蛋白的分子量为121 921 u,等电点为8.80。氨基酸序列的同源性分析显示,草鱼TLR9与鲤TLR9的同源性最高(85%),依次为斑马鱼(82%)、大西洋鲑(55%)、虹鳟(55%)。在系统发生树上,草鱼TLR9首先与鲤科的鲤和斑马鱼聚类。通过半定量RT-PCR检测可知,草鱼TLR9在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达最高,其次为血、头肾等。这些结果为进一步深入研究TLR-9的功能及开发草鱼免疫增强剂奠定基础。     

池塘两种养殖方式下草鱼的营养差异

为了解传统池塘养殖和池塘内循环系统养殖草鱼的营养差异,对2种养殖方式草鱼的营养成分及营养品质进行了比较研究。结果显示,池塘养殖草鱼肌肉水分、粗脂肪含量、脏体比以及pH降低值和滴水损失高于循环养殖系统的草鱼,而肌肉粗蛋白含量和抗氧化能力低于循环养殖系统的草鱼。池塘养殖和循环系统养殖草鱼肌肉必需氨基酸构成比例均符合FAO/WHO的标准,必需氨基酸均是赖氨酸(Lys)含量最高;池塘养殖草鱼氨基酸总量(∑TAA)、鲜味氨基酸总量(∑DAA)和甜味氨基酸总量(∑SAA)低于循环养殖系统;根据氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS),2种模式的第一限制性氨基酸均为缬氨酸(Val)。循环养殖系统草鱼肌肉∑n-3PUFA和∑n-6PUFA含量显著低于池塘养殖,但肌肉EPA+DHA含量是池塘养殖的1.5倍。研究表明,草鱼营养组成合理,池塘内循环系统养殖的草鱼在营养成分及鲜甜味方面优于池塘养殖。     

草鱼hsp70和hsp90对温度急性变化的响应

为研究不同温度条件下草鱼热休克蛋白(hsp70和hsp90)的表达模式,了解草鱼对温度的耐受和适应机理,实验将在20℃下驯化的草鱼在7个实验温度(22,24,26,28,30,32和34℃)中热激3h,然后20℃恢复2h,取肝脏,肌肉和鳃测定hsp70和hsp90表达.结果表明,hsp70和hsp90表达量随着温度升高而上升,当温度达到34℃时,肌肉与鳃热休克蛋白基因表达量显著下降,草鱼耗氧率、热休克蛋白表达和死亡率之间的关系符合氧限制热耐受理论(OCLTT).基于OCLTT理论,草鱼生理临界温度为28℃,当温度超过28℃,热休克蛋白表达所需能量主要由无氧代谢提供,进而导致体内氧自由基和变性蛋白的增加,影响草鱼的生长和存活.     

草鱼全基因组微卫星特征分析与亲子鉴定

为分析草鱼全基因组微卫星特征并开发高多态性微卫星标记亲子鉴定平台,实验利用已发布的草鱼全基因组序列,开发高度多态、准确度高、重复单元在4～6碱基范围的微卫星标记.结果显示,在草鱼900.51 Mb基因组序列中共筛选到微卫星序列677363个,总长度12 835 407 bp,占全基因组长度的1.4254％,平均跨度为1...     

草鱼体脂性状的变异特征及相关性

为探究草鱼体脂性状的变异特征及相关性,采用数理统计方法对296尾17月龄草鱼的15个数量性状指标进行综合分析评价。结果显示,草鱼体脂性状(腹脂指数IPF、肝胰脏粗脂肪含量HLC、肌肉粗脂肪含量MLC)具有丰富的变异特征,变异系数范围为21.30%～47.04%。相关分析发现,草鱼3个体脂性状之间呈现显著正相关,表明草鱼脂质沉积在不同组织中具有一定的同步性。进一步的因子与聚类分析显示,观测的15个草鱼数量性状大致分为4类,包括体型因子、体尺因子、脏器指数因子和体脂含量因子,其中IPF归属于脏器指数因子,HLC和MLC二者组成体脂含量因子。多元统计分析发现,草鱼形态性状对3个体脂性状变异的解释量范围为7.45%～24.83%,相较而言,矢状面体型SS可在一定程度上预测体脂性状。研究表明,草鱼体脂性状具备较大的选育潜力,其中IPF整体显示出较好的关联性,可作为代表性目标性状用于育种实践。本研究为草鱼体脂性状选择育种提供了重要参考依据。     

不同乳酸菌对发酵草鱼品质的影响

为探明不同乳酸菌对发酵草鱼微生物数量和理化性质的影响,进一步提高发酵鱼制品的品质,实验对草鱼背部肌肉经不同乳酸菌(植物乳杆菌、戊糖片球菌和副干酪乳杆菌)发酵后制品的微生物数量、pH、总酸、水分含量、白度、氨基酸态氮、硫代巴比妥酸和挥发性盐基氮等进行分析,探究不同乳酸菌在草鱼发酵过程中(0～15d)对其品质的影响.结果显...