斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白抗体的制备

将含有斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）神经坏死病毒（orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV）的主衣壳蛋白（main capsid protein，MCP）基因的重组质粒pET32a-MCP转入大肠杆菌BL21后，用异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，用柱层析纯化表达的融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，制备抗MCP融合蛋白的血清。用ELISA方法检测抗血清的效价，用Western—blot检测抗血清的特异性。结果显示，获得的抗血清稀释1：22000倍时仍呈阳性，并能有效中和OGNNV，实验组的相对存活率达54．50％。这说明，本研究用纯化的MCP融合蛋白制备兔抗OGNNVMCP抗体是成功的，并证实了OGNNV主衣壳蛋白的免疫原性。本研究旨为重组表达主衣壳蛋白基因制备抗OGNNV疫苗提供科学依据，并为进一步研究提供重要的实验材料。     

闽南地区斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)神经坏死病毒的基因型与分子进化研究

本研究以闽南地区具有典型神经坏死病症状的斜带石斑鱼为材料,采用RT-PCR法对其进行病毒检测,对检测到的阳性序列进行双向测序和构建系统发育树,对病毒颗粒进行分离纯化,并通过分子进化模型分析病毒衣壳蛋白基因所受的选择压力。结果显示,采集到的6个石斑鱼样品均呈NNV阳性,系统树分析发现6个样品的PCR扩增片段均为RGNNV基因型序列,表明闽南地区感染石斑鱼的神经坏死病毒主要为RGNNV基因型病毒;通过PEG法对病毒进行分离提纯,获得直径为25~28 nm、呈二十面立体对称结构的无囊膜病毒颗粒;分子进化分析显示NNV外壳蛋白基因经历了纯化选择,表明病毒在进化过程中没有出现遗传变异并以相对恒定保守的速率进化。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒症的防除对策

介绍了斜带石斑鱼神经坏死病毒症(VNN)的防除措施，包括切断NNV的垂直传播和水平传播途径。近期该病在广东省大亚湾水产试验中心得到有效的控制，具体措施为：亲鱼的健康管理，亲鱼在产卵前用PCR方法进行病毒检测，亲鱼产卵及仔稚鱼饲育水体的消毒处理，受精卵消毒，育苗池及育苗器具的消毒，育苗车间的隔离等。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA( short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链( 19 nt) -环(4 nt) -负链(19 nt)].化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA -124、pshRNA-896和pshRNA-NNV.然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化.结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47％、68％、51％.3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好.Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60％、96％和55％,与对照组相比差异显著(P＜0.05).研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础.     

谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR)与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒(NNV)的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显著消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因 shRNA干扰载体的构建及效果评价

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。     

斜带石斑鱼牛磺酸转运蛋白基因的克隆及饲料牛磺酸含量对其表达的影响

牛磺酸转运蛋白(Taurine transporter,TauT)是牛磺酸跨膜转运的重要载体,在鱼类的生长、代谢及性成熟过程中发挥重要作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,克隆体质量(12.85±0.46)g的斜带石斑鱼Epinephelus coioides TauT cDNA蛋白质编码区序列。结果表明:斜带石斑鱼TauT cDNA蛋白质编码区为1 881bp,编码626个氨基酸,分子量为70 126.80Da,与已克隆的其他鱼类的同源性很高,而与鸟类和哺乳动物的同源性较低。在水温(27±2)℃下,给斜带石斑鱼投喂含牛磺酸0%、0.5%、1%和1.5%的饲料28d后,用Realtime PCR法检测不同组织中TauT mRNA的相对表达量,结果表明:TauT mRNA在所测的各组织中均有表达,但肝脏、心脏、脑表达水平最高,肾脏、鳃、脾脏次之,肠道、肌肉、脂肪组织最低。牛磺酸添加组中组织TauT mRNA的表达量均高于对照组,1.0%和1.5%两组间差异不明显,但均高于0.5%组。饲料中添加牛磺酸能促进斜带石斑鱼组织中TauT mRNA的表达。     

斜带石斑鱼形态性状与体质量的相关性和通径分析

对4月龄斜带石斑鱼体质量、头长、躯干长、体长、全长、体高、体宽、眼间距、眼径、吻长、尾柄高和尾柄长等12个性状的测量数据进行了多元分析,以明确斜带石斑鱼形态性状与体质量的相互关系。结果显示,斜带石斑鱼的各形态性状间相互关系达极显著水平(P0.01);通径分析结果表明,全长(x_4)、体高(x_5)、眼间距(x_7)、眼径(x_8)和尾柄高(x_(10))对体质量的通径系数达极显著水平(P0.01),其中全长的直接影响最大,而体高、眼间距、眼径和尾柄高主要通过全长间接影响体质量;这5个性状对体质量的共同决定系数之和为0.920,说明全长、体高、眼间距、眼径和尾柄高是影响4月龄斜带石斑鱼体质量的主要性状;回归分析建立了4月龄斜带石斑鱼形态性状与体质量的回归方程。本研究可为斜带石斑鱼的选择育种提供参考。     

中国对虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用3’和5’RACE技术从中国对虾Fenneropenaeus chinensis肝胰腺中克隆了1个血蓝蛋白基因FCHc,FCHc基因cDNA全长为2161bp。其中,开放阅读2 034bp,编码678个氨基酸,预测分子量为77.59 kDa。FCHc序列与凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血蓝蛋白同源性为82%,与日本囊虾Marsupenaeus japonicas同源性为85%。Real-timePCR实验结果表明,FCHc在肝胰腺中的相对表达量最高,在心脏和表皮中几乎不表达。该基因在鳗弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国对虾FCHc基因在免疫反应中具有重要作用。     

石斑鱼神经坏死病毒传播途径阻断的初步研究

本文报告了斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）苗种培育中亲鱼、卵、饵料等几个关键环节的病毒携带检测以及几种药物对病毒的消除效果的试验。用RT—PCR法检测斜带石斑鱼亲鱼的粪便、卵、仔鱼、稚鱼,饵料轮虫、桡足类中都有检出神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）。聚维酮碘5—10mg／L浸泡卵20min、浸泡轮虫和桡足类30min,盐酸吗啉胍3～5mg／L浸泡卵30min、浸泡轮虫和桡足类40min,聚维酮碘5mg／L＋盐酸吗啉胍3mg／L浸泡卵20min、浸泡轮虫和桡足类30min可有效灭活所携带的神经坏死病毒活性。     

赤点石斑鱼病毒性神经坏死症的组织病理和电镜观察

用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测患病赤点石斑鱼苗，呈Beta诺达病毒阳性。光学显微镜下观察到病鱼的脑、视网膜、脊髓有空泡．在脑部，空泡主要分布在端脑、间脑和小脑。受感染的细胞明显收缩、致密变化和嗜碱性。包涵体常为圆形，大小不一。透射电镜下，在感染细胞的细胞质可观察到含有病毒粒子的致密体。病毒粒子呈等面体，无外膜，直径为25～28nm，随机分布在细胞质或在致密体内排列成品格状。致密体大小不一。偶尔观察到较大致密体的外膜已破裂，病毒粒子被释放到细胞质。     

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervous necrosis virus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原.发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染.2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E. malabaricus)、青石斑鱼(E. awoara)、赤点石斑鱼(E. akaara)和云纹石斑鱼(E. moara)中检出5个神经坏死病毒分离株.检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%.对这些病毒的RT-PCR产物421 bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%.将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelus spp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上.对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒.结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原.RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法.     

Modelling the effect of vaccination on transmission dynamics of nervous necrosis virus in grouper larvae Epinephelus coioides

Nervous necrosis virus (NNV) infection in susceptible grouper larvae has been reported to cause high mortalities, leading to great economic losses in aquaculture industry. Although the effects of NNV vaccines on grouper have been broadly investigated, vaccination strategies have not been fully established. To this end, we introduced the parsimonious epidemiological models that explored the assessment of key epidemiological parameters and how they changed when vaccinations showed the effects. We showed that the models capture the published cumulative mortality data accurately. We estimated a basic reproduction number R₀ = 2.44 for NNV transmission in grouper larvae without vaccination. To effectively control NNV transmission by vaccination, a model for disease control was also generalized to attain the goals of controlled reproduction number less than 1. Our results indicated that at least 60% of grouper population needed to be immunized for ~75 min. Our data-driven modelling approach that links the transmission dynamics of NNV and vaccination strategies for grouper has the potential to support evidence-based planning and adaptation of integrated control measures. We encourage that the epidemiology-based framework introduced here can be further implemented for establishing effective vaccination and mitigation actions aimed at controlling diseases in fish farming practices.     

斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究

从患病的斜带石斑鱼肝和肾组织分离的两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、VITEK-AMS-32自动微生物分析鉴定及药敏试验,经形态和生理生化测定,确定为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。组织病理变化主要表现为鳃、肝和肾细胞变性、坏死,病变组织炎性细胞浸润,呈变质性炎症。     

深水抗风浪网箱斜带石斑鱼生长研究

研究深水抗风浪网箱养殖斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的生长特性。经过125 d的养殖,斜带石斑鱼体重由15.2 g增加到102.8 g,平均日增长率为4.610%,体重和时间的关系式为M=12.247e0.014 7 t;全长由9.67 cm增加到19.36 cm,平均日增长率为0.802%,全长与时间的关系式为L=0.063 7 t+9.186 3;体重和全长的关系式为M=0.012 7 L3.051 1。     

石斑鱼人工育苗技术研究

通过对点带石斑鱼人工育苗生产试验,从饵料准备、环境条件控制、管理措施等方面进行了探索。共培育出规格5～8cm的石斑鱼苗60多万尾。