中华绒螯蟹微卫星多重PCR体系的建立及其亲子鉴定应用

利用自主开发的微卫星标记对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)进行微卫星多重PCR体系构建,最终成功建立4组多重体系,每组体系包含4个微卫星位点,并成功应用于3个家系的亲子鉴定中。结果显示:(1)本研究筛选的16个微卫星标记,平均观测杂合度为0.8206,平均期望杂合度为0.8164,平均多态信息含量为0.7927,具有丰富的多态性;(2)运用Cervus 3.0软件对已知系谱信息的3个中华绒螯蟹家系共95个子代个体进行亲子鉴定分析,结果显示,选用任意两组微卫星多重PCR体系时,累积实际正确鉴定率均超过94.74%;使用任意三组微卫星多重PCR体系时,累积实际正确鉴定率均大于98.95%;使用四组微卫星多重PCR体系时,累积实际正确鉴定率达到100%。并且当选用组合1、2和组合3,或者选用组合1、3和组合4时,对3个家系的累积正确鉴定率达到了100%,因此选用这些组合不但可以获得准确的系谱信息,还能减少工作量,降低成本。本研究构建的微卫星多重PCR体系能为中华绒螯蟹的种群选育和家系管理提供便捷、高效的途径。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星多重PCR体系的建立及其在家系亲权鉴定中的应用

为了在遗传分析研究中提高效率并节约成本,本研究从已报道的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星位点中选取多态性较高的位点,基于各位点的扩增片段大小及退火温度等因素进行微卫星位点的组合.通过不断优化位点组合、反应体系及反应程序,成功建立了1个五重、2个四重和1个三重PCR反应体系,并将其应用于11个凡纳滨对虾家系的亲权鉴定.结果显示,四组多重PCR体系中的16个微卫星位点在11个凡纳滨对虾家系中的平均等位基因数(Na)为6,平均多态信息含量(PIC)为0.5813,平均观测杂合度(Ho)为0.513,平均期望杂合度(He)为0.636.利用Cervus3.0软件,对已知系谱关系的11个凡纳滨对虾家系进行亲权分析,其第一亲本累积排除率(CE-1P)、第二亲本累积排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为0.99525487、0.99990862和0.99999986.进一步分析表明,当同时使用四组多重PCR体系进行亲权分析时,其模拟配对率和亲权鉴定准确率均为100％,全同胞和半同胞家系鉴别效果良好,表现出准确的鉴别能力.本研究所建立的四组凡纳滨对虾微卫星多重PCR体系均可为后续的凡纳滨对虾遗传多样性分析和亲权鉴定提供高效、准确的检测手段.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星多重PCR体系的建立及其在家系亲权鉴定中的应用

为了在遗传分析研究中提高效率并节约成本,本研究从已报道的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星位点中选取多态性较高的位点,基于各位点的扩增片段大小及退火温度等因素进行微卫星位点的组合。通过不断优化位点组合、反应体系及反应程序,成功建立了1个五重、2个四重和1个三重PCR反应体系,并将其应用于11个凡纳滨对虾家系的亲权鉴定。结果显示,四组多重PCR体系中的16个微卫星位点在11个凡纳滨对虾家系中的平均等位基因数(Na)为6,平均多态信息含量(PIC)为0.5813,平均观测杂合度(Ho)为0.513,平均期望杂合度(He)为0.636。利用Cervus3.0软件,对已知系谱关系的11个凡纳滨对虾家系进行亲权分析,其第一亲本累积排除率(CE-1P)、第二亲本累积排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为0.99525487、0.99990862和0.99999986。进一步分析表明,当同时使用四组多重PCR体系进行亲权分析时,其模拟配对率和亲权鉴定准确率均为100%,全同胞和半同胞家系鉴别效果良好,表现出准确的鉴别能力。本研究所建立的四组凡纳滨对虾微卫星多重PCR体系均可为后续的凡纳滨对虾遗传多样性分析和亲权鉴定提供高效、准确的检测手段。     

大黄鱼微卫星多重PCR体系的建立及其应用

利用本实验室开发的微卫星标记,通过优化退火温度、引物浓度、循环次数等条件,建立了3组大黄鱼微卫星多重PCR体系,每组包含3个微卫星位点,用3组微卫星多重PCR分析了一个大黄鱼选育群体JD-01的遗传多样性。结果显示,该群体的平均等位基因为12.111,平均有效等位基因为7.408,平均多态信息含量为0.846,平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.825、0.868,香农多样性指数为2.165。运用Cervus 3.0软件,对已知系谱关系的9个大黄鱼家系及对应亲本进行了亲子鉴定分析,以验证3组微卫星多重PCR在亲子鉴定中的准确性。结果显示,使用该3组微卫星多重PCR体系进行亲子鉴定准确率为100%。大黄鱼微卫星多重PCR体系的建立为分析群体的遗传多样性、亲子鉴定和辅助家系管理提供了一种高效的技术手段。     

微卫星三重PCR基因扫描技术在中国明对虾家系标识中的应用

在开发中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物的基础上,利用3对微卫星引物,克隆编号分别为H081、RS0683和RS1101,构建中国明对虾的三重PCR稳定扩增体系。在此基础上,进一步利用荧光标记引物的基因扫描技术(Genescan)对利用精荚移植技术建立的中国明对虾7个半同胞家系和16个全同胞家系进行识别研究。结果表明,该项技术可以准确地把7个半同胞家系的子代个体间、16个全同胞家系的子代个体间以及总的31个全同胞家系的子代个体间区别开,且能准确把这些家系产生的任意子代个体定位到各个家系。该技术可以满足大批量家系材料样本的分析,具有较好的应用价值。[中国水产科学,2007,14(1):59-66]     

短蛸微卫星多重PCR体系建立及交配模式分析

本研究对实验室开发的12对短蛸(Amphioctopus fangsiao)高多态性微卫星标记进行优化组合,构建了4组三重PCR体系,对短蛸4个母本(♀1、♀2、♀3和♀4)、104个子代及19个候选父本进行亲权鉴定,分析其交配模式。结果显示,构建的4组三重PCR体系可有效鉴定短蛸的亲权关系,104个子代鉴定率为94.23%。♀1组样品鉴定出12个子代,父本数为3个;♀2组样品鉴定出40个子代,父本数为7个;♀3组样品鉴定出19个子代,父本数为2个;♀4组样品鉴定出27个子代,父本数为4个;并且♂2、♂3、♂7和♂10均与2个以上的母本发生了交配。由此分析得出,短蛸交配模式存在多雌多雄关系。研究结果为高效开展短蛸人工繁育、增养殖及放流工作提供了重要参考。     

利用微卫星标记高效鉴定松浦镜鲤的亲缘关系

用37尾雌和14尾雄松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu构建37个血统明确的全同胞家系,同池、同条件养殖。用筛选出的9个多态性微卫星标记和建立的多重PCR检测方法进行子代群体(1 318尾)的亲权鉴定。9个位点共检测到53个等位基因,各位点均为高度多态(PIC0.5),平均期望杂合度为0.742,观测杂合度为0.755。亲本基因型信息的模拟分析显示,利用9个标记将子代分配到亲本对的成功率可达100%。实际鉴定结果:1 287尾个体准确鉴定到配组的亲本对,鉴定成功率为97.6%。以上结果表明:本研究提供的标记和检测方法可用于松浦镜鲤的亲本遗传距离分析和家系亲缘追溯,也适用于群体遗传多样性监测。     

皱纹盘鲍4个养殖群体杂交子代生长与存活状况比较

为利用杂种优势培育皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)优良新品种,本研究以4个不同养殖群体[黄岛(HD)、荣成(RC)、日本(JP)、大连(DL)]的皱纹盘鲍为亲本,设计4×4完全双列杂交,建立了4个自交家系和12个正反杂交家系,在利用微卫星标记进行亲子鉴定的基础上,对各家系的F1在1、5、13、17月龄时的生长性状、杂种优势率、生长速度和存活情况进行比较,分析杂交效应。结果表明,在各个生长阶段均有部分杂交家系与自交家系相比表现出显著的生长优势;HDRC、HDDL和JPDL家系的生长速度较高;HDDL、HDJP、RCDL、JPRC及RCHD家系有着较高的存活率;在杂种优势方面,HDRC、HDDL与DLHD家系在各生长参数与生长速度上有明显的杂种优势,HDDL、RCDL、DLHD家系在存活率上表现出明显的杂种优势。本研究筛选出的具有优势的交配组合,可作为皱纹盘鲍生产上种苗来源的参考,也为利用杂种优势培育皱纹盘鲍新品种提供了基础资料。     

利用微卫星标记进行马氏珠母贝家系遗传结构分析与系谱认证

为改良马氏珠母贝养殖群体性状,2010年4月,从马氏珠母贝选育系F3选择性腺成熟个体为亲本,建立了36个家系,按照常规技术进行幼体培育和海区养成.2010年11月,从36个家系中随机选取4个家系,每个家系取样30个个体,利用13对微卫星引物进行家系遗传结构和系谱鉴别分析.结果显示,(1) 13个微卫星引物在4个家系中共检测到39个等位基因,每个位点的等位基因数为2～5,4个家系的平均观测杂合度(Ho)为0.531 ～0.597,平均期望杂合度(He)为0.474 ～0.507；(2)根据子代基因型成功地推断出4个家系的亲本基因型,据此鉴别各个家系；用UPGMA法对120个样本进行聚类分析,98.3％的同一家系的子代个体能够聚到一起,分类结果与系谱来源基本一致.结果说明,这4个家系具有较高的遗传多样性和家系间具有明显的遗传分化；微卫星标记能有效地为马氏珠母贝群体的系谱分析提供技术支持.     

微卫星多重PCR在水生动物亲权分析中的研究进展

微卫星标记作为共显性标记具有分布广泛、中性遗传的特点,在群体遗传结构分析和亲子鉴定(即亲权鉴定)方面已有了广泛应用,通过微卫星标记技术可以清楚有效地分析子代的遗传背景。本文就目前微卫星多重PCR在水生动物亲权关系分析、系谱认证方面的研究进展进行了综述。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

Movement of the fluvial form of masu salmon, <Emphasis Type="Italic">Oncorhynchus masou masou</Emphasis>, in a mountain stream in Kyushu,Japan

Using mark-recapture methods, the movements of the fluvial form of masu salmon (Oncorhynchus masou masou) in a mountain stream on the island of Kyushu, Japan, were studied. Most (78%) of the masu salmon were recaptured in the pool in which they had been originally caught and tagged. Of those that moved between pools, the proportion of individuals that moved during the breeding period was not significantly higher than the proportion that moved during the non-breeding period. However, during the breeding period, a higher proportion of larger salmon moved than did smaller fish. The proportion of mobile large males during breeding period was higher than that for small males. Also, it was found that a few individuals showed long-range movement in the autumn. As a long-term movement, 78 individual fish (65%) that were recaptured more than three times showed high sedentary tendencies. Sixteen individual mobile fish (13%) moved and returned to the original pool. Fluvial form of masu salmon in Kyushu show a high sedentary nature; however, large mature males seem to actively move in search of female during breeding period.     

仿刺参与虾夷马粪海胆和菲律宾蛤仔混养效果的初步研究

水温13.8～20.0℃下,在容积50 L的塑料水槽中,放养体质量为(1.4±0.6)g的虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)11个,过量投喂海带(Laminaria japonica),再分别混养体质量为(3.4±0.6)g的仿刺参(Apostichopusjaponicus)0(A组)、3(B组)、5(C组)和10个(D组),体质量为(12.4±1.7)g的菲律宾蛤仔(Ruditapes philippim2rum)6个,排出水培养底栖硅藻和石纯(Ulva lactuca),用底栖硅藻饲喂仿刺参.77 d的饲养表明,仿刺参和海胆的成活率差异不显著(P>0.05),但混养组海胆的特定生长率(SGR)显著高于单养组(P<0.05),B、C和D组海胆的SGR分别比单养高9.12%、7.24%和10.06%,各混养组间差异不显著(P>0.05);混养海胆的饲料系数(7.28～7.70)分别显著低于单养(9.12)(P<0.05)组20.2%、15.5%和18.0%.将刺参的产量计算在内,B、C和D组海胆的饲料系数分别比对照组降低31.5%、26.8%和16.0%,但混养组间差异不显著(P>0.05).海胆和仿刺参的适宜混养比例为11:3.蛤仔和石纯生长慢,死亡率高.养殖排水培养的底栖硅藻以菱形藻(Nitzschia sp.)和卵形藻(Cocameissp.)为主,少量舟形藻(Navicula sp.).混养海胆性腺中亚麻酸、EPA DHA含量和n-3/n-6比值显著大于单养组(P<0.05),混养池水中氨氮含量低而稳,溶氧量高.     

青鱼和鲇肠道排泄物对养殖水体铜绿微囊藻休眠体复苏的影响及作用途径

为探讨养殖水体底栖鱼类肠道排泄物对铜绿微囊藻休眠体复苏的影响,将青鱼和鲇肠道排泄物与铜绿微囊藻休眠体用野外养殖水域沉积物(底泥)混匀包埋,在10、15和20°C梯度温度下进行休眠体复苏实验。结果显示,铜绿微囊藻休眠体主要复苏期为第3～15天,在10和15°C条件下,青鱼排泄物组(MP)、鲇排泄物组(SA)和青鱼-鲇排泄物混合组(MP-SA)铜绿微囊藻休眠体复苏率均显著高于对照组(CK),且MP组也显著高于SA组和MP-SA组;在20°C条件下,MP组铜绿微囊藻休眠体复苏率显著高于SA组、MP-SA混合组和CK组,但SA组和MP-SA组与CK组复苏率并无显著性差异。实验过程中MP组沉积物中优势菌群以假单胞菌为主,SA组和MP-SA组优势菌群分别以芽孢杆菌和厚壁菌为主,第0～12天为菌群增殖期,且此期间沉积物-水体界面(SWI)实验MP组、SA组和MP-SA组溶解氧含量(DO)和氮磷比(N/P)均显著低于对照组。研究表明,青鱼和鲇肠道排泄物能促进铜绿微囊藻休眠体复苏,且这种促复苏效果在低温区间(10～15°C)更显著,可能是排泄物中菌群在生长增殖期降低了沉积物-水体界面N/P和DO的结果。研究结果对养殖水体底泥清淤和春季铜绿微囊藻水华防控具有一定的理论意义。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

珠江口海域双胞旋沟藻赤潮对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性

为研究2009年10月下旬在广东珠海海域爆发的双胞旋沟藻赤潮对养殖鱼类及水体中其它生物的影响,实验以卤虫幼体、金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗作为受试生物,在赤潮现场测试双胞旋沟藻对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性效应。结果显示,24 h双胞旋沟藻对卤虫幼体的LC₅₀(半致死浓度)为9.55×10⁴/mL,藻密度为2.5×10³/mL的双胞旋沟藻对卤虫幼体的LT₅₀(半致死时间)为48.5 h。60 h内该赤潮水体对鱼苗和虾苗的存活无不利影响,卤虫幼体和金鼓鱼苗均可摄食双胞旋沟藻,卤虫幼体对双胞旋沟藻的摄食率低。研究表明,双胞旋沟藻赤潮水体对卤虫幼体有一定的毒性作用,但在低藻密度条件下,卤虫幼体能以该藻为食并维持其生命,双胞旋沟藻对金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗无急性毒性作用。     

Use of Microbacterium sp. and Exiguobacterium mexicanum to improve the survival and development of Artemia under xenic conditions

The effect of Microbacterium sp. strain 8L and Exiguobacterium mexicanum strain 8N was evaluated in the diet of Artemia under xenic conditions. Viable cultures of bacteria were provided to xenic cultures of Artemia in combination with Sacharomyces cerevisiae, cornflour or Spirulina, and the effect on the survival and growth was recorded. The use of these bacterial strains improves significantly the survival of Artemia independently of the used food (P < 0.05), and variable results were observed in the growth.     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.