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相似文献
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1.
19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析   总被引:6,自引:0,他引:6       下载免费PDF全文
从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-Tvector载体筛选阳性重组子进行序列测定.结果显示,OmpK基因分别含有786bp~849 bp的开放读码框,编码261~282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%~100%,推测氨基酸序列的相似性为71%~100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高.序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌.本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性.由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础.  相似文献   

2.
李明云  丁文超  陈炯  史雨红 《水产学报》2010,34(10):1559-1565
溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21 pLys E,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的抗血清建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为104 CFU/mL,能特异性检测出溶藻弧菌,与其他菌株无交叉反应。  相似文献   

3.
参照GeneBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp,编码214个氨基酸。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a( ),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为温度37 ℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1:30,000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为了进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果,构建了真核表达重组质粒pCDNA-OmpW,然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织均存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,红笛鲷不同组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明,红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western- blot分析表明,DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒试验结果表明,免疫保护率高达60 %,可见pCDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。  相似文献   

4.
自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.  相似文献   

5.
哈氏弧菌特异性检测方法的建立和应用   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
针对哈氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计了一对引物,从分离自患病长鳍真鲨体内的哈氏弧菌基因组中扩增获得一段约800 bp大小的基因片段.进行了PCR方法的特异性和敏感性以及海产品检测试验,建立了一种检测致病性弧菌的PCR检测方法.结果表明,该法只检测出致病性哈氏弧菌.同时对不同浓度的细菌悬液扩增,结果显示,此方法对哈氏弧菌菌体DNA的最低检测量为0.139 ng/μL,可以为哈氏弧菌的检测提供参考依据.  相似文献   

6.
哈维氏弧菌为我国海水鱼类养殖过程中的常见病原,为了进一步探究哈维氏弧菌的致病机制,本实验分别从前期筛选到的哈维氏弧菌强毒株H2LB1和弱毒株H1SAI3中提取胞外产物(ECPs),并通过蛋白质组学进行差异蛋白鉴定。从中选取了哈维氏弧菌强毒株特异性蛋白HutZ为研究对象,对其功能和免疫原性开展深入研究。首先利用qRT-PCR检测了哈维氏弧菌在不同铁源培养基培养条件下的HutZ基因表达量差异,进一步将克隆HutZ基因连接到原核表达载体上,并在大肠杆菌中成功表达出重组HutZ蛋白。将纯化的HutZ蛋白与血红素共孵育,检测发现该蛋白能够结合血红素并改变其光吸收峰。将HutZ蛋白乳化后免疫半滑舌鳎2次,以间接血凝法检测免疫后1—7周的血清效价,同时在免疫4周后进行攻毒检测其免疫保护率。研究表明,HutZ蛋白免疫后的半滑舌鳎抗体效价最高可达1∶128,攻毒免疫保护率达73.3%,说明HutZ蛋白可作为开发预防半滑舌鳎感染哈维氏弧菌的亚单位疫苗的有效候选抗原。  相似文献   

7.
摘要:对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析,并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明,鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24kD,38kD,42kD和47kD,主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性,只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明,氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42kD的主要外膜蛋白的表达,随着抗菌素浓度的增加,该外膜蛋白的表达量逐渐减少甚至消失,而庆大霉素浓度的变化对其表达没有明显影响。对该42kD主要外膜蛋白进行N末端分析表明,其N末端序列为EAPTAINS,与已发表的细菌其他外膜蛋白序列没有同源性。  相似文献   

8.
Bfr(Bacterioferritin)是细菌主要的储铁蛋白和重要的免疫相关蛋白。为探索哈维氏弧菌Vibrio harveyi Bfr蛋白的免疫特性,本研究利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达哈维氏弧菌Bfr重组蛋白(r Bfr),并进行纯化,进一步通过动物模型评估r Bfr的免疫特性。结果显示,成功表达了哈维氏弧菌Bfr蛋白,Bfr蛋白分子量大小约为25 ku;表达的重组蛋白主要以可溶性形式存在;免疫小鼠结果显示,r Bfr蛋白能激发小鼠产生高水平的特异性抗体,r Bfr具有较好的免疫原性;利用斑马鱼Danio rerio建立哈维氏弧菌感染模型,表明哈维氏弧菌对斑马鱼无致病性。本研究证实了哈维氏弧菌Bfr具有免疫原性,为进一步研制哈维氏弧菌亚单位疫苗和核酸疫苗提供了参考和借鉴。  相似文献   

9.
鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性   总被引:19,自引:3,他引:16       下载免费PDF全文
分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)主要外膜蛋白(MOMP),通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明,SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中,SDS-PAGE电泳图谱不同,鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD;溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD,其中,45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较,Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后,分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示,兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带,其分子量分别为97kD、51kD和30kD,说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关;兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带,其分子量分别为51kD和27kD,说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关,而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。  相似文献   

10.
采用延伸PCR技术拼接副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus VpATCC17802)的外膜蛋白K基因ompK和鞭毛蛋白A基因flaA,获得融合基因flaA-ompK。制备高纯度的r-OmpK,r-FlaA及r-FlaA-OmpK蛋白。分别以所制备的OmpK、FlaA-OmpK和混合蛋白OmpK+FlaA作为免疫原,通过口服及注射的方法免疫黑石斑鱼(Centropristisstriata),研究其免疫原性及对野生副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保护作用。ELISA分析结果表明,注射FlaA-OmpK组抗体效价最高,是OmpK组的2倍,是混合蛋白组的4倍,注射FlaA-Ompk提供的免疫保护率达到80%。本工作制备了FlaA-Ompk肠溶口服微球疫苗,口服免疫组血清抗体效价低于注射组血清抗体效价,口服FlaA-Ompk提供的免疫保护率达到50%。研究结果显示融合蛋白FlaA-Ompk具有良好的免疫原性,可作为多元弧菌疫苗抗原成份。  相似文献   

11.
鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
欧阳岁东 《水产学报》2006,30(4):566-570
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21(DE3)by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.  相似文献   

12.
采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV) VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1 -VP3(L1)、pET32a-VP3( L2)、pGEX-6P1-VP3( L3)和pGE...  相似文献   

13.
蜕皮抑制激素(molt—inhibiting hormone,MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)家族。MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)眼柄总RNA为模板,根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt—inhibiting hormone-1,Ers—MIH1)基因序列设计引物,用RT—PCR的方法获得了Ers—MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明,Ers—MIH1基因成熟肽编码区含有228bp,编码75个氨基酸残基,与已发表的序列一致。将该cDNA片段插入到中间载体pMD18-T中,酶切后再将该片段插入到pGEX-4T-1表达载体中,构建成表达质粒pGEX-4T—MIH1。在BL21细胞中经IPTG诱导表达,得到GST—MIH1的融合蛋白。SDS—PAGE分析表明,经0.1mmol/L IPTG诱导4h,发现大量GST—MIH1融合蛋白表达,在分子量(Mr)为34kD处有1条特异的蛋白质条带。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。  相似文献   

14.
取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106~108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。  相似文献   

15.
从患病大黄鱼病灶中分离出病原哈维氏弧菌,并人工回接感染大黄鱼,病鱼出现典型的皮肤溃疡症。测定大黄鱼血液各项指标发现,病鱼单核细胞、嗜中性粒细胞、血栓细胞百分率明显下降,而淋巴细胞百分率增加,均呈极显著差异(P<0.01)。患病大黄鱼总蛋白为(12.8±3.95)g/L,对照组鱼为(19.4±4.33)g/L,病鱼球蛋白、甘油三脂、血糖含量也明显低于对照组(P<0.01)。然而病鱼谷丙转氨酶为(37±5.11)IU/L,对照组为(28±5.54)IU/L;病鱼谷草转氨酶为(164±47.19)IU/L,对照组为(117±21.84)IU/L,均呈极显著差异(P<0.01)。研究结果说明,病鱼肝脏和肾脏组织受损。对患病大黄鱼进行病理组织学观察,结果发现病鱼病变组织头肾、肝出现不同程度的变性以及坏死。细胞超微病变观察发现,头肾肾小管上皮细胞变性、坏死。肝细胞胞浆内脂滴积累多。血清指标的测定可以作为大黄鱼哈维氏弧菌病细菌感染的指标。  相似文献   

16.
致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测   总被引:2,自引:1,他引:1       下载免费PDF全文
从山东沿海的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1.4kb的特异性片段。DNA序列分析表明,该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因,该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99.0%和98.5%;与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)热稳定性溶血素基因(TDH)的相似性为74.5%;与拟态弧菌(V.mimicus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、霍乱弧菌(V.chderae)磷脂酶基因的序列相似性分别为57.4%、59.2%、53.0%;与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌(V.hollisae)、河流弧菌(V.tguvialis)、鳗弧菌(V.anguillarum)的溶血素基因的相似性仅为19.9%~24.8%。根据溶血素基因的保守区段,设计了1对特异引物。分析表明,该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0.001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测,结果检出8株哈维氏弧菌,检出率为14.55%,从健康动物中检出数占所检弧菌数的6.25%,海洋环境为10.53%,海水养殖环境为26.53%,表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在,在养殖水体中的数量高于其他海水环境。  相似文献   

17.
Bacteria isolated from an outbreak with moderate mortalities in farmed sole, Solea senegalensis (Kaup), in the south of Spain were identified as Vibrio harveyi and V. parahaemolyticus. Only bacterial strains showing swarming were virulent in sole and caused mortalities in experimentally inoculated fish. However, the signs of the disease were only reproduced with V. harveyi. The intramuscular inoculation of the extracellular products (ECPs) of both species produced mortalities in inoculated fish and the appearance of surface ulcers in the case of V. harveyi. However, the inoculation of sublethal doses of ECPs to fish showed a protective effect against V. harveyi.  相似文献   

18.
Bacterial subcellular components and probiotics were successful for the stimulation of immunity and the prevention of Vibrio harveyi infections in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Rainbow trout were immunized with whole inactivated cells of V. harveyi to obtain polyclonal antibodies against specific antigens. Western blotting showed a unique reactive band (∼93 kDa) between serum and bacterial proteins from outer membrane proteins (OMP) and extracellular products (ECP). Probiotics were selected according to their capability to inhibit V. harveyi . Two of these bacteria, i.e. A3-47 and A3-51, showed cross-reactivity with V. harveyi antiserum. Their OMPs and ECPs were reactive with V. harveyi antiserum in bands of ∼93 kDa for A3-51 and higher for A3-47. In vivo tests determined that fish fed with A3-51 produced cross-reactive antibodies against V. harveyi and also, the survival of these fish infected with V. harveyi was high, being similar to the level achieved with vaccinated fish. Thus, the probiotics, when administered as live preparations, were capable of producing cross-reactive antibody against specific bacterial pathogens.  相似文献   

19.

为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白, 运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒, 转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白, 运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白, 结果显示, 中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因, 将其与表达载体pGEX-4T-1连接后转化大肠杆菌诱导表达获得重组AK蛋白(rAK), 通过pull-down实验进一步证实rAK可与rVP110发生结合。克氏原螯虾(Procambarus clarkia)体内中和实验结果显示, rAKWSSV感染克氏原螯虾具有一定的中和作用, 能延缓螯虾的死亡进程。另外, 中国明对虾在人工感染WSSV, 荧光定量PCR检测结果显示, AK基因表达水平显著上调, 18 h时达到峰值, 然后下降至正常水平; 酶底物法检测结果同样显示, 鳃细胞中AK酶活性在感染WSSV后发生显著上调。本研究旨在为深入了解WSSV囊膜蛋白VP110WSSV感染宿主过程中的作用提供基础依据。

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