盐度胁迫对尼罗罗非鱼免疫相关指标的影响

为探究盐度胁迫对尼罗罗非鱼免疫的影响，对体质量(35.0±5.0) g的尼罗罗非鱼进行了急性和慢性的盐度胁迫实验，对免疫相关指标进行了检测和分析。在急性盐度胁迫中，设置0、5和15盐度组，分别在胁迫后6、12、24、48和96 h进行取样，检测血清SOD、CAT、GSH-Px和AKP的活性。在慢性实验中，设置0、10、20和30盐度组，胁迫8周后检测血清SOD、CAT、GSH-Px和AKP活性，并进行了无乳链球菌易感性实验。结果显示：①血清中SOD活性在急性盐度胁迫6、12和24 h时都有随盐度上升而上升的趋势，但在96 h时盐度15组酶活性显著低于盐度5组；在慢性盐度胁迫下，各组的酶活性呈现出随着盐度升高而显著性下降的趋势。②血清CAT活性在急性盐度胁迫下12和24 h时呈现出随着盐度升高而显著下降的趋势；在慢性胁迫下不存在显著性差异。③血清中GSH-Px活性在急性和慢性胁迫后，均呈现随着盐度升高而降低的趋势。④血清AKP活性在胁迫后6 h随盐度升高呈现出显著下降趋势；在慢性盐度胁迫下，盐度20组显著低于其他实验组。⑤尼罗罗非鱼对无乳链球菌易感性实验中，盐度10组的易感性和盐度0组之间无显著差异，盐度20和30组的易感性高于盐度0组。研究表明，两种盐度胁迫均会引起免疫相关指标的变化，急性盐度胁迫实验表明，盐度5和15可导致尼罗罗非鱼机体氧化损伤，但尼罗罗非鱼可以逐渐适应这一变化；慢性盐度胁迫实验表明，盐度高于20会抑制尼罗罗非鱼多种免疫指标活性，造成其对无乳链球菌的易感性升高。     

吉富罗非鱼感染无乳链球菌后肝脏组织在不同时期蛋白质组的表达差异

为研究罗非鱼感染无乳链球菌前后肝脏组织蛋白质的表达变化。本研究以吉富罗非鱼为材料，采用双向电泳技术分析其在无乳链球菌感染胁迫下24 h、48-144 h、12 d与对照组（未感染）肝脏组织蛋白质组的变化，对差异表达蛋白进行质谱分析鉴定。结果显示：吉富罗非鱼在无乳链球菌胁迫下，3个实验组的蛋白质图谱与对照组相比存在显著差异，共有30个蛋白点发生显著改变，其中13个表达上调，17个下调，2个下调蛋白点在感染12 d组消失。通过MALDI-TOF-MS MS/MS质谱分析和数据库检索对这些蛋白质进行了功能分类，发现它们涉及到能量代谢、细胞防御与应激、消化免疫、抗氧化与排毒等许多方面。推测这些蛋白可能在吉富罗非鱼对无乳链球菌胁迫的抗性反应中发挥了重要作用。研究结果为无乳链球菌疫苗的研制及吉富罗非鱼抗病品种选育奠定了基础。     

海豚链球菌感染对不同品系罗非鱼血液生化指标和肝脏HSP70 mRNA表达的影响

以吉富罗非鱼、新吉富罗非鱼、埃及尼罗罗非鱼和红罗非鱼为研究对象,饲养100d后,进行海豚链球菌(2.95×108CFU/mL)感染试验,分析攻毒前后各品系罗非鱼的血液生化指标和肝脏HSP70 mRNA表达量的变化规律。另从各桶中取20尾鱼进行同样的攻毒试验,统计攻毒后各时间点的累积死亡率。结果表明,感染海豚链球菌96h后,吉富罗非鱼和新吉富罗非鱼对病原较为敏感,累积死亡率分别达到36.67%和38.33%;埃及尼罗罗非鱼对病原敏感性较差,试验期间未见死亡。吉富罗非鱼、新吉富罗非鱼和红罗非鱼血清皮质醇和葡萄糖水平以及肝脏HSP70 mRNA的表达量在攻毒后明显提高,血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶与溶菌酶活力也呈上升趋势,碱性磷酸酶活力与甘油三酯和胆固醇水平低于攻毒前。埃及尼罗罗非鱼可以利用糖原和脂类产生的能量,提高了HSPS与一些特定免疫蛋白(溶菌酶、球蛋白等)的合成,增强了鱼体的非特异性免疫力。罗非鱼选育过程中,需要将抗病力与生长性能进行有效的结合,在注重生长速度的同时也要增强其抗应激能力,从而为罗非鱼产业的可持续发展提供保证。     

河豚卵处理物对吉富罗非鱼生长性能、血液生化及抗菌感染的影响

为了探究不同添加水平的河豚(Takifugu rubripes)卵处理物对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长性能、血液生化以及海豚链球菌感染后的存活率的影响,试验选取525尾平均体重为(0.66±0.01)g的吉富罗非鱼,随机分为7组,每组3个重复,每重复25尾鱼,依次饲喂河豚卵处理物添加水平为0、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%和6.4%的饲料,养殖8周。结果显示:随着河豚卵处理物添加水平的提高,试验鱼体增重、特定生长率、肝体比和脏体比均先上升后下降最后趋于稳定,饲料转化率显著降低,各组肝体比无显著差异,0.8%河豚卵处理物添加组罗非鱼的脏体比显著高于其他组。随着河豚卵处理物添加水平的提高,罗非鱼血液中红细胞、血红蛋白、红细胞比容含量显著下降,白细胞数量呈逐渐上升的趋势;罗非鱼血清中总胆固醇和血糖含量显著下降,血清中溶菌酶含量呈逐渐下降的趋势。罗非鱼腹腔注射5×10~7 CFU/mL海豚链球菌后,各组罗非鱼24 h内均未出现死亡;感染48～96 h,对照组罗非鱼累计存活率最低;感染192 h后,6.4%河豚卵处理物添加组罗非鱼累计存活率显著高于对照组。结果表明:饲料中添加河豚卵处理物对吉富罗非鱼的生长性能、血液生化指标产生影响,增强了罗非鱼抗海豚链球菌病感染的能力。     

异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果, 本研究采用 10%甲醛溶液灭活法制备了无乳链球菌 HN0901 和 GX1101 胞外产物灭活疫苗, 通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂), 在免疫后 28 d 用同/异源无乳链球菌攻毒, 测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价, 并比较了罗非鱼在腹腔注射 1×108 CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。 结果显示, 免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后 28 d 显著高于对照组, 但在攻毒后显著低于对照组; 与对照鱼相比, 免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高, 丙二醛(MDA)显著降低(P＜0.05)。实时定量 PCR 结果显示, 炎性细胞因子基因 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β, 体液免疫相关基因 HSP70, MHC Ⅱ和 IgM 在免疫和攻毒后也呈现显著升高趋势, 并显著高于对照组(P＜0.05)。血清抗体效价于免疫后第 28 天达到 1∶6400, 显著高于对照组(P＜0.05)。攻毒实验结果显示, 免疫组在同源和异源无乳链球菌攻毒后相对的免疫保护率在 31.6%~47.4%。结果表明, 研制的灭活疫苗免疫罗非鱼后, 能够显著诱导罗非鱼体内的免疫应答, 产生中等疫苗效力, 对同/异源无乳链球菌都具有免疫保护能力。本研究结果为深入研究罗非鱼链球菌病的免疫预防技术和研制二价疫苗奠定了基础。     

不同罗非鱼品系感染无乳链球菌后对血液和肝胰腺生化指标的影响

为探究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染后对罗非鱼的血液和肝胰腺生化指标的影响，本研究以吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗病选育系F5代、奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus × O. niloticus)、吉富罗非鱼“百桂”品系为对象，通过人工腹腔注射感染无乳链球菌，检测感染后不同时期肝胰腺和血液中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)活性的变化。结果显示，奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼“百桂”品系的平均死亡率分别为55.4%、60.5%和78.6%，表明奥尼罗非鱼抗感染能力最强；3个品系感染无乳链球菌后，肝胰腺组织中的ACP、AKP、SOD和T-AOC酶活力均呈先升高后下降的趋势，其中，在感染后24 h，奥尼罗非鱼的AKP和CAT酶活力显著高于吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼“百桂”品系；而感染后24 h，血清中ACP、AKP、LZM、CAT和T-AOC酶均显著升高，而SOD酶则下降，其中，奥尼罗非鱼的ACP、AKP、CAT和T-AOC酶活性明显高于吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼”百桂”品系。综合比较6种酶在感染后不同时期的活性变化及3个品系的感染存活率，筛选出AKP和CAT作为评估罗非鱼抗无乳链球菌感染能力强弱的指标。     

鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用

为探讨池塘种植鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用,在养殖池塘中分别种植0%(对照组)、5%、10%和15%池塘面积的鱼腥草,养殖90 d后进行无乳链球菌人工感染,分别在感染后0、24、48和72 h采集吉富罗非鱼肝脏,进行肝脏生化、抗氧化性能、组织病理和热休克蛋白70基因(HSP 70)表达研究。结果显示,感染后48和72 h对照组肝脏谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性最高,种植鱼腥草各组吉富罗非鱼肝脏ALT活性在感染前后均无显著性变化,感染后72 h,10%组吉富罗非鱼肝脏AST活性已恢复到感染前水平。抗氧化指标显示,种植鱼腥草能减缓链球菌感染引起吉富罗非鱼肝脏总抗氧化能力(T-AOC)下降,显著提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和一氧化氮合酶(NOS)等抗氧化酶的活性,增加自由基清除能力,减少脂质过氧化丙二醛(MDA)的产生。组织病理学观察显示,对照组吉富罗非鱼感染后48 h肝窦明显淤血,肝索排列紊乱,肝细胞脂肪变性,而各种植鱼腥草组吉富罗非鱼在感染后仅表现为肝细胞明显嗜酸,肝窦轻度扩张。定量PCR结果显示,每组吉富罗非鱼肝脏HSP 70表达量在感染后都显著升高,感染后各时间点对照组吉富罗非鱼肝脏的HSP 70表达量均显著高于鱼腥草种植组。研究表明,种植鱼腥草能显著改善链球菌感染所造成的吉富罗非鱼肝脏AST和ALT上升,提高抗氧化应激能力,减轻链球菌感染引起的病理损伤;吉富罗非鱼通过肝脏HSP 70高表达促进受损蛋白质的早期修复与降解,种植鱼腥草具有抗炎作用和提高鱼体抵御病原菌的能力。     

无乳链球菌不同途径感染吉富罗非鱼后病原菌在体内的分布规律研究

为探讨无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染罗非鱼(Oreochromis spp)的致病途径。采用腹腔注射、灌胃和浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行无乳链球菌(HN016菌株)胁迫感染,利用平板活菌计数法统计三种方式感染后病原菌在体内组织的分布。注射和灌胃两种方式感染后均出现典型的链球菌感染发病症状,其中注射组在感染24 h后出现死亡高峰,死亡率为92.5%;灌胃组感染48 h后出现死亡高峰,死亡率为90%;而浸泡组,感染后均没有出现明显的发病症状,也没有出现死鱼。注射组和灌胃组在感染后2 h,其脾脏、肝脏、前肾、胃、腮、皮肤和肌肉组织中均可分离出病原菌,5 h后在脑组织中均可分离出病原菌,8 h后各组织分离出的病原菌数达到峰值;而浸泡组在感染8 h后才从各组织中分离出病原菌,且它们的数量均低于同时期的注射组和灌胃组。注射和灌胃两种方式可使吉富罗非鱼快速感染无乳链球菌而发病,而浸泡方式感染后病原菌虽可以侵入机体,但不表现出症状。由此,我们推测在自然条件下养殖的罗非鱼是通过口腔采食携带无乳,链球菌的食物而被感染。     

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果

链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。     

高温应激下无乳链球菌感染对尼罗罗非鱼血清生化指标和组织病理的影响

为探究高水温对尼罗罗非鱼无乳链球菌病暴发的影响,以体质量为(62.0±3.33)g的尼罗罗非鱼为研究对象,设置生长最适宜组(29°C)和高温应激组(33°C)2个处理水平,暂养7 d后分别进行人工感染实验统计累计死亡率,并于攻毒后0、12、24、48、96和120 h采集血液和组织样本,开展高温应激下无乳链球菌感染对尼罗罗非鱼血清生化指标和组织病理影响的研究。结果显示,水温33°C高温应激组尼罗罗非鱼累计死亡率显著高于29°C组;谷丙转氨酶(ALT)活性在感染96 h之后33°C组的值显著高于29°C组;谷草转氨酶(AST)活性在感染48 h之后33°C组的值显著高于29°C组;钾(K+)和钠(Na+)含量感染120 h时29°C组的值和攻毒前都没有显著性差异,而33°C组分别显著高于和低于攻毒前;肌酐(CREA)含量在感染12 h以后33°C组的值都显著高于29°C组;白蛋白/球蛋白(A/G)的值在120 h时33°C组的值显著低于29°C组;血清碱性磷酸酶(AKP)活性29°C组随时间延长而升高,33°C组则先升高后降低,但33°C组的达峰时间更短;超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化趋势都是先升高后降低再升高;组织病理学观察显示高温应激使肝细胞排列紊乱,索状结构不清,脾脏和肾脏轻微充血;感染12 h后脾脏均严重充血,感染24 h后脾脏结构均被破坏,呈淀粉样变性,坏死;感染48 h后肾小球均发生萎缩,肾小管上皮细胞变性、坏死;33°C组鱼的肝脏感染96 h后严重脂肪变性和细胞内玻璃样变性,而29°C组鱼的肝脏在感染120 h后才发生相似的病理变化。研究表明高温应激抑制了鱼体免疫系统,降低了尼罗罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力,脾脏对无乳链球菌感染响应最快,高温应激使病原菌感染对肝脏损伤更为迅速,感染后期受损更严重。