波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA还原酶差异比较

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异，本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28℃和4℃下的生长及三甲胺（TMA）、生物胺和挥发性盐基氮（TVB-N）的生成；通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因（torA），利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示，杀鲑气单胞菌在28℃生长较快，而波罗的海希瓦氏菌在4℃生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺，波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺，在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因，2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%，而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52，甘氨酸含量最高，而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74，丙氨酸含量最高，蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA 和鸟氨酸脱羧酶（DOC）基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见，波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌，其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强，与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。     

大黄鱼源气单胞菌的分离鉴定及致腐表型

为鉴别大黄鱼腐败菌气单胞菌的致腐能力,采用生理生化和分子方法(16S r RNA)鉴定冷藏大黄鱼货架期终点不产H2S的菌株。分析菌株在体外培养条件下的生长、胞外酶活性、三甲胺(TMA)和生物胺形成的腐败表型,将菌株接种在灭菌鱼汁中测定其致腐能力。结果显示,分离株AE03和AE04在0~37°C及0~60的盐度下生长良好,在4和25°C条件下AE03菌株的生长速率显著高于AE04菌株。2株细菌不产H2S,能还原氧化三甲胺(TMAO),分解尿素和液化明胶,氧化酶、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶等都呈阳性,能利用葡萄糖。结合16S r RNA鉴定发现分离株AE03为杀鲑气单胞菌,AE04为软体动物气单胞菌。在体外培养中,2种气单胞菌均能产生蛋白酶、形成TMA和生物被膜,其中AE03菌株生成各指标的能力高于AE04菌株,同时AE03菌株还具有脂酶活性,产生生物胺,其中尸胺含量较高。气单胞菌AE03在灭菌鱼汁中产生的挥发性盐基氮(TVB-N)显著高于AE04。通过紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136 2种报告菌检测发现,2株气单胞菌是高丝氨酸内酯(AHLs)产生菌,其中AE03菌株产生的AHLs含量显著高于AE04菌株。研究表明,杀鲑气单胞菌AE03为冷藏大黄鱼的强致腐菌,且能分泌高含量的AHLs,研究为从群体感应角度阐明气单胞菌的致腐机理奠定了良好的基础。     

比较基因组学分析鱼源荧光假单胞菌的致腐和适应性

为探究荧光假单胞菌的强致腐和环境适应性,实验通过分析2株海水鱼源荧光假单胞菌的蛋白酶活性和挥发性盐基氮(TVB-N)的形成,并采用比较基因组学方法解析致腐和适应机制。结果显示,荧光假单胞菌PF07和PF08在冷藏鱼汁中的蛋白酶活性强,积累较多TVB-N。经全基因组测序、组装和功能注释后,得到PF07基因组长度为6.13 Mb,GC含量61.4%。通过泛基因组分析可知,PF07与PF08核心基因共4 980个,独特基因分别有516和470个。COG和KEGG注释显示2株致腐菌基因组中参与氨基酸代谢基因占比最高,PF07独特基因参与无机离子转运代谢居多。碳水化合物活性酶CAZy注释表明,2株荧光假单胞菌基因组中糖苷转移酶与糖苷水解酶基因均占比最高,还鉴定得到大量分解碳水化合物、蛋白质和脂质等多种底物的酶和相关蛋白基因,特别有碱性金属蛋白酶AprA、多胺ABC转运蛋白渗透酶PotC、精氨酸与鸟氨酸脱羧酶等多种降解蛋白酶。另外,2株致腐菌分布有rpoS、rpoN和rpoD多种σ因子。2株鱼源荧光假单胞菌表现出强的致腐性,研究通过比较基因组学方法解析荧光假单胞菌分布多种编码蛋白酶和腐胺形成的氨基...     

养殖大黄鱼冷藏过程中细菌菌相的变化

采用感官、挥发性盐基氮(TVBN)、菌落总数对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)在0℃、5℃冷藏过程中的品质变化特征进行分析,并对细菌菌相进行定性和定量研究。结果表明,冷藏初期、高品质期和货架期终点菌落总数N(CFU/g)的对数值(lgN)分别为5.40±0.17、6.98±0.17、7.38±0.09,TVBN分别为(7.00±1.82)mg.100-1.g-1、(13.00±1.42)mg.100-1.g-1、(29.92±1.75)mg.100-1.g-1。冷藏初期分离获得211株菌株,84.8%是革兰氏阴性菌,出现少量革兰氏阳性菌(6.2%),优势菌群是肠杆菌科细菌(6.6%)、气单胞菌属(14.2%)、不动杆菌属(13.3%)、摩氏杆菌属(11.8%),并出现了一定比例的假单胞菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和其他细菌。冷藏过程中细菌菌相逐渐变得单一,腐败希瓦氏菌上升趋势明显。高品质期时,0℃冷藏大黄鱼优势菌群为腐败希瓦氏菌(45.8%)和缺陷短波胞单胞菌(13.6%);5℃冷藏大黄鱼优势菌群为腐败希瓦氏菌(37.9%)和假单胞菌属(15.6%)。货架期终点时,0℃、5℃冷藏大黄鱼优势菌为腐败希瓦氏菌,比例分别为75.5%和59.6%。     

植物精油对冷藏大黄鱼优势腐败菌的抑制作用及其机制

为探讨天然植物精油对冷藏大黄鱼贮藏过程中优势腐败菌的抑制作用及其机制,实验首先对冷藏大黄鱼的优势腐败菌进行分离纯化,并通过16S r DNA序列分析及生理生化实验进行菌株鉴定;采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测14种植物精油或其组分对腐败菌株的抑菌活性;在阐明植物精油抗菌活性的基础上,再对植物精油处理后的大黄鱼气味进行感官可接受度检验,以筛选出具有高效抗菌活性和良好感官接受性的精油保鲜剂;实验通过细菌形态扫描电镜观察、胞内乳酸脱氢酶及核酸释放研究山苍子精油对不同腐败菌株的膜损伤作用,以初步阐明其抗菌机制;最后,通过检测微生物数量、产硫菌数量、挥发性盐基氮(TVB-N)及组胺含量变化来考察山苍子精油对冷藏大黄鱼潜在的保鲜效果;从冷藏大黄鱼中分离得到6株优势腐败菌,分别为腐败希瓦氏菌4株,热杀索丝菌1株,温和气单胞菌1株;14种植物精油对腐败菌株具有不同抑制活性,其中肉桂醛抑菌活性最强,最低抑菌浓度为0.125μL/mL,其次为丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油,最低抑菌浓度均≤0.5μL/mL;丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油使用后未导致大黄鱼气味的感官劣化,且可矫正大黄鱼肉的腥味;山苍子精油可破坏腐败菌株的细胞膜,并导致胞内蛋白酶和核酸外泄。经4μL/mL山苍子精油处理后,冷藏过程中大黄鱼片的菌落总数、产硫菌数、TVB-N及组胺含量显著降低。研究表明,肉桂醛、丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油对大黄鱼特定腐败菌具有显著抑制作用,芳香酚和富含柠檬醛的精油使用后不影响大黄鱼的感官接受性,有望作为天然保鲜剂用于冷藏海产品的保鲜。     

采用Illumina MiSeq测序技术比较日本鲭和大黄鱼冷藏期间的腐败特性

为比较日本鲭和大黄鱼肌肉中微生物和代谢功能的变化及其与鱼肉腐败特性之间的关系，本研究检测了2种鱼在冷藏过程中的理化指标和菌落总数的变化，利用Illumina Miseq测序技术分析细菌群落变化，并利用皮尔森相关性分析检验微生物与鱼肉腐败及组胺产生相关性，结合功能预测分析细菌群落组成与代谢功能之间的关系。结果显示，冷藏期间日本鲭和大黄鱼的pH、挥发性盐基氮、组胺、菌落总数等均呈上升趋势，且日本鲭上升较快；冷藏末期2种鱼TVB-N值和组胺含量分别达到76.34、59.98和59.92、3.11 mg/100 g；日本鲭肌肉中细菌丰富度和多样性先增加后减少，大黄鱼则整体呈下降趋势；2种鱼肌肉中的优势腐败菌均为希瓦氏菌属；日本鲭体内与TVB-N产生相关的菌共12种，其中10种与组胺产生具有显著相关性；大黄鱼体内与TVB-N产生相关的菌共7种，但未检测出与组胺产生具有相关性的细菌；冷藏过程中氨基酸代谢和碳水化合物代谢为最主要的代谢通路，日本鲭样品组氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸代谢相关基因和丁酸丁酯代谢、丙酸酯代谢及丙酮酸代谢丰度均显著高于同一时期的大黄鱼，本实验从微生物代谢水平解释了日本鲭比大黄鱼更易腐败的原因，为不同水产品腐败特性的研究提供新思路。     

冷却链大黄鱼货架期预报系统的开发与评估

通过使用Visual Basic编程语言,完成了基于0~10℃腐败希瓦氏菌生长动力学模型建立的冷却链大黄鱼货架期预报系统的设计,验证了货架期预报系统的准确性。采用以自然污染鱼得到的实验数据建立特定腐败菌生长动力学模型的方法,提高了预测的准确性,腐败希瓦氏菌和剩余货架期预测值与实测值的可靠性评估表明,其相关系数R2分别为0.936和0.935,显示开发的冷却链大黄鱼货架期预报系统可以快速可靠地预测冰鲜大黄鱼的鲜度与剩余高品质期和货架期。系统开发过程中采用免安装处理,方便用户使用。     

1株大黄鱼源肺炎克雷伯菌的分离鉴定与致病性分析

近年来由肺炎克雷伯菌感染水产动物引发的病害频繁发生，严重阻碍了水产养殖业的健康发展。采用细菌分离培养和形态学观察手段自人工饲养发病的大黄鱼肝脏内分离到1株疑似致病菌KPLYC2,并进行鉴定，通过回归感染试验发现，分离株KPLYC2可引起与自然发病大黄鱼相似的症状及致其死亡，分离株KPLYC2对大黄鱼的半数致死密度为6.8×10⁶ cfu/mL,而且可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显组织病理性损伤。分离株KPLYC2还可感染小鼠引发全身多系统性病理损伤。经过生理生化特征检测及16S rRNA序列分析和构建进化树发现，分离株KPLYC2与肺炎克雷伯菌的基因相似度超过99%,因此将分离株KPLYC2鉴定为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示，肺炎克雷伯菌KPLYC2对氨苄西林、青霉素G和四环素等不敏感。笔者首次自大黄鱼体内分离出1株肺炎克雷伯菌并研究其致病性和耐药性，获得的数据将对该病的防控提供参考和依据。     

3株方斑东风螺病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的敏感性试验

采用K-B法,测定腐败希瓦氏菌、鲍鱼希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌3株方斑东风螺病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的敏感性.结果显示:腐败希瓦氏菌对大观霉素、氯霉素、头孢吡肟、诺氟沙星、链霉素、复方新诺明6种抗菌药 物敏感；鲍鱼希瓦氏菌对头孢吡肟、大观霉素、头孢噻肟、氨曲南、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、红霉素、哌拉西林、头孢哌酮、米诺环素、克拉霉素、多粘菌素B、妥布霉素、庆大霉素15种抗菌药物敏感；海藻希瓦氏菌对大观霉素、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松、红霉素、氧氟沙星、左氟沙星、头孢他啶、头孢呋辛、氯霉素、哌拉西林、克拉霉素、诺氟沙星、米诺环素、复方新诺明、链霉素、呋喃妥因、庆大霉素、多粘菌素B21种抗菌药物敏感.     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清，建立了5种菌的间接ELISA检测方法，并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示，5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish；制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000；交叉反应结果显示，鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应；抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml；对13株海水鱼类细菌分离物进行检测，有1株腐败希瓦氏菌阳性，两株哈维氏弧菌阳性；1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性，该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

Desalted Cod Spoilage Flora Inhibition by Citric Acid and Potassium Sorbate Combination

ABSTRACT

Desalted cod spoilage isolates were tested in culture broth for growth inhibition by citric acid and potassium sorbate. Preservative effect was also evaluated in refrigeratedcod juice and desalted cod spiked with Shewanella putrefaciens and Pseudomonas fluorescens orputida. Combination of 0.15% citric acid and 0.1% potassium sorbate inhibited growth of approximately 60% of isolates, including the former two strains. Total inhibition was observed for S. putrefaciens and partial inhibition was noticed for P. fluorescens or putida, in both treated juice and desalted cod. Preservatives delayed growth of halotolerant bacteria in cod. Citric acid plus potassium sorbate addition lowered the pH to extend desalted cod shelf life.     

LC-MS/MS检测水产品源致病菌和腐败菌群体感应AHLs信号分子

为分析水产品源致病菌和腐败菌中群体感应信号分子AHLs的含量和种类,实验建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时检测细菌群体感应11种AHLs类信号分子的技术,并与生物报告菌法比较。结果显示,报告菌紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136检测发现嗜水气单胞菌和2株铜绿假单胞菌是AHLs产生菌。建立的LC-MS/MS能完全分离和检测11种AHLs,并发现假单胞菌和嗜水气单胞菌产生的AHLs信号分子含量较高,其中ATCC 9027和ATCC 15692产生3-oxo-C12-HSL,嗜水气单胞菌A2产生C4-HSL,而腐败希瓦氏菌XH4分泌的C4-HSL信号分子含量较低,沙门氏菌ATCC 14028-3、大肠杆菌O157:H7和3种弧菌的AHLs很低。随着细菌浓度的增加,铜绿假单胞菌ATCC 9027产生的AHLs含量逐步增加,在12 h达到最高。研究表明,LC-MS/MS可用于多种AHLs信号分子的定性和定量检测,具有灵敏性与准确性更高的优点。在11株水产品源致病菌和腐败菌中,假单胞菌和气单胞菌分泌的AHLs含量最高。     

Identification of bacteria from the normal flora of perch, Perca fluviatilis L., and evaluation of their inhibitory potential towards Aeromonas species

Pathogenic Aeromonas sobria has been identified as a causative agent of ulcerative disease in farmed European perch, Perca fluviatilis L. To study the effect of the normal intestinal bacterial flora of perch against A. sobria, we sampled 193 bacterial isolates from the perch digestive tract. The isolates were identified by sequence analysis of the 16S rRNA gene and their inhibitory potential against A. sobria was evaluated in vitro. Nineteen of the strains isolated showed inhibition and were also tested against other aeromonad and non-aeromonad fish pathogens including Yersinia ruckeri and Vibrio anguillarum. Isolates showing inhibition were primarily Pseudomonas spp.; however, inhibitory Shewanella spp., and Delftia sp. were also identified. A Pseudomonas chlororaphis isolate showed inhibition against all fish pathogens tested.     

Effect of surimi processing on dimethylamine formation in fish meat during frozen storage

Trimethylamine-N-oxide (TMAO) degrades to dimethylamine (DMA) and formaldehyde, which cause a decline in fish quality. Suppression of DMA formation in frozen surimi was investigated using croaker, lizardfish, and walleye pollock. The leaching process in surimi processing was shown to reduce not only the TMAO, iron, and taurine content, but also to reduce unidentified factors that accelerate DMA formation in lizardfish muscle; in contrast, unidentified factors that suppress DMA formation were reduced in croaker and pollock muscle. Sucrose, used as a cryoprotectant, was shown to decrease DMA formation in vitro, likely due to the reduction in freezing-induced concentration of solutes. The effects of pH on DMA formation were different in minced frozen meat among the three species. DMA formation was not observed in croaker when the pH varied between 6 and 8. On the other hand, DMA was elevated in lizardfish under acidic conditions, and DMA formation in pollock was maximal when the pH of the meat was neutral. Thus, the suppression of TMAO degradation by surimi processing results from the removal of TMAO, iron, and reductants from fish meat; sucrose also reduces DMA formation. Furthermore, unidentified factors in croaker, lizardfish, and pollock meat substantially affect DMA formation.     

养殖大黄鱼加工和冰藏过程中鲜度和细菌类型的变化

通过对养殖海水以及捕获、加工、流通和冰藏等整个供应链过程养殖大黄鱼的温度履历、感官、化学、微生物的品质监测,评估养殖海水、碎冰和加工过程中大黄鱼细菌卫生状况,分析其在整个过程鲜度和细菌相变化。结果表明,养殖海水和碎冰的菌落总数分别为4.99±0.41 lg cfu/g和3.90±0.32 lg cfu/g,大肠菌群数分别为30~450 MNP/100 g和低于30 MNP/100 g;新捕获养殖大黄鱼的菌落总数为3.82±0.38 lg cfu/g,假单胞菌数为3.13±0.58 lg cfu/g,嗜冷菌数为2.82±0.60 lg cfu/g,大肠菌群数为低于30 MPN/100 g;冰藏第18天时TVBN含量为28.62±0.51 mg/100 g,菌落总数、假单胞菌数、嗜冷菌数和大肠菌群数分别为6.24±0.06lg cfu/g、6.01±0.25 lg cfu/g、5.68±0.21 lg cfu/g和30 MPN/100 g。养殖海水和新捕获鱼中细菌种类繁多,革兰氏阴性菌分别占其总菌株数的64.9%和56.8%;革兰氏阳性菌分别占其总菌株数的27.0%和42.0%;优势菌群为黏性威克斯菌、腐败希瓦氏菌和假单胞菌属。加工结束后,假单胞菌(34.9%)、玫瑰小球菌(32.6%)和缺陷短波单胞菌(14.0%)成为主要菌群。冰藏第4天时仅分离出4种不同类型的细菌,腐败希瓦氏菌比例上升明显,冰藏第10天和第18天时,所占比例分别为63.5%和69.1%,是冷却链养殖大黄鱼产品的优势腐败菌。     

预报微生物学及其在食品货架期预测领域的研究进展

预报微生物学研究食品腐败的过程和腐败优势细菌的消长变化情况 ,该领域获得的数值信息为食品货架期监测预报系统的开发打下了坚实的基础。为了准确预报产品的货架期 ,必须考虑整个食品微生态系统。本文略述了与食品腐败相关的微生物学研究 ,并引入了特定腐败菌的概念。在此基础上 ,讨论了预报微生物学在食品货架期预测领域面临的挑战和研究进展 ,并以腐败假单胞菌为例 ,简要介绍了预报模型的建立步骤和货架期预报系统的开发过程。