异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测

2008年10月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病，从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检验；测定了菌株（JY081016-1）的16S rRNA和gyrB基因序列，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性，菌株（JY081016-1）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1448bp（GenBank 登录号：GQ232759），所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp（GenBank 登录号：GQ232760），其16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上；根据分离菌的表型及分子特征，判定分离鉴定的4株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血；设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。     

鲤病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病鲤(Cyprinus carpio L.)体内分离到一株优势生长菌,人工感染试验证明该菌对鲤有较强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等生物学性状检验;测定了分离菌的16S rRNA和gyrB基因的部分序列,并与相关细菌16S rRNA和gyrB基因序列进行比对后,构建了基于两种基因的系统发生树。结果显示:分离菌所扩增的16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中鳗利斯顿氏菌的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上,其16S rRNA基因序列长度为1449 bp(GenBank登录号:FJ824662),gyrB基因序列长度为1202 bp(Gen-Bank登录号:GQ452957);胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌具有淀粉酶、蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有脂酶活性;在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上,呈β型溶血,分离菌均具有金属蛋白酶基因及溶血素基因。根据分离菌的表型特征及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell1986)的鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等12种药物耐药,对克林霉素等5种药物敏感,对恩诺沙星等32种药物高度敏感。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

引起三疣梭子蟹"牛奶病"的酵母菌18S rRNA序列测定与分析

"牛奶病"是近年来秋、冬季三疣梭子蟹暂养过程中发生的一种危害较大的流行性疾病,患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的酵母菌.根据GenBank中的假丝酵母菌的18S rRNA基因序列设计合成引物,用PCR扩增患"牛奶病"三疣梭子蟹上分离到的酵母菌的部分18S rRNA基因,PCR产物经纯化回收后克隆入pUCm-T载体,筛选出阳性克隆进行测序,测序结果与已发表的序列进行同源性比较,同时以蟹源弧菌和寄生虫的DNA样本为对照.结果,所测序列与GenBank中假丝酵母菌的18S rRNA基因的同源性为84.4%～100%.同时,仅从试验用酵母菌DNA样本中扩增出了532bp左右的特异性片段,其他对照样本均未出现扩增反应.说明本实验建立的检测酵母菌的PCR方法有效.     

团头鲂源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

建立肺炎克雷伯氏菌感染团头鲂的模型,为团头鲂疾病的有效检验与防治及鱼类病原肺炎克雷伯氏菌的进一步研究提供参考和依据。2014年8月江苏省常州市某养殖场暴发出血病,团头鲂大量死亡,濒死团头鲂呈现轻微细菌性败血症症状,但未见大量充血发红,仅腹部、鳍基部有出血点,鳃丝发白,肠道无食物,肝胰腺轻微充血发红。采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,于濒死团头鲂的肝、脾中分离到优势菌株CZBY-1,进行了形态观察、药敏试验、毒力因子检测等,并对其16S rRNA基因序列(Gen Bank登录号:KF413424)进行分析。构建系统发育树确定供试菌株与肺炎克雷伯氏菌同源性最高,在99%以上,结合表型及分子生物学分析,判定为肺炎克雷伯氏菌,人工回感可导致团头鲂死亡并呈现同检测鱼患病特征。利用设计的特异性引物进行外膜蛋白C(ompC)基因的PCR扩增,发现分离菌在252 bp对应位置有明显扩增条带,证明其具有毒力因子ompC。药敏试验表明,菌株对磷霉素、复方新诺明等27种抗生素敏感,对链霉素、妥布霉素、万古霉素3种抗生素耐药。     

长鳍真鲨源哈氏弧菌的主要生物学性状研究

从两尾病死的观赏用长鳍真鲨Oceanic whitetip shark，Carcharhinus longimanus L．中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等生物学性状检验。同时，测定了16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发育树。结果表明，8株供试纯培养菌（编号：HQ050226—1至HQ050226—4、HQ050227-1至HQ050227—4）为弧菌属（Vibrio Pacini 1854）的哈氏弧菌（Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936）。所扩增的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区），HQ050226—1株为1463bp（GenBank登录号：EF635305）、HQ050227—1株为1464bp（GenBank登录号：EF635306），与GenBank数据库中哈氏弧菌的同源性在98％及99％。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等33种敏感。     

利用16S rRNA和COI基因序列对三疣梭子蟹不同群体遗传特征的比较分析

采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体和我国山东即墨市会场村群体3个野生群体的16S rRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平。结果显示,我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16S rRNA片段构建的NJ系统树所反映的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于与日本蟳的分类关系上,基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支;而青蟹属的3种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的两种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。     

锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定

对从病死锦鲤(Cyprinus carpio L.)肝组织中分离的2株菌(编号:HC050630D-1、HC050630D-2)进行了形态特征、理化特性、药物敏感性及对健康鲤鱼的致病作用等方面的检验;测定不HC050630D-1株菌的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树.结果表明,2株被检菌为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii),对健康鲤鱼未呈现明显致病作用;所测菌株的16S rRNA基因序列长度1450 bp,在GenBank中登录号为EF669479,该菌株16s rRNA基因序列与GenBank数据库中不动杆菌属细菌的16S rRNA基因序列同源性为99%;药敏试验结果显示对供试的头孢拉啶等21种药物坚现高度敏感或敏感,对头孢他啶等7种呈低度敏感,对青霉素G等9种耐药.     

黄金鲫温和气单胞菌鉴定及溶血素基因检测

采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,从患病的黄金鲫体内分离到的优势菌YD-1进行了回感试验、表观生物学、药敏试验及毒力因子检测等系统性研究。结果表明,该菌在盐度1-3%、PH4-9,温度10-30℃的营养肉汤培养基中均能生长。该菌株16S rRNA基因序列（GenBank收录号: KC561935, 长度1446bp）和gyrB基因序列（GenBank收录号: KC561934, 长度1169bp）分别与其他气单胞菌属细菌的基因同源性相思似在97%-99%之间,构建系统发育树确定该菌株为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。人工回感试验可引起健康银鲫死亡。对该菌毒力因子进行检测,可扩增出溶血素基因片段。药敏试验显示：该菌对多粘菌素、头孢呋辛、米诺环素、复达新、菌必治、新霉素等6种药物敏感。     

养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1的检出及组织病理学分析

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因, 应用组织病理学、 分子生物学和荧光原位杂交等技术手段, 对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现, 患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降, 行动迟缓, 鳃水肿; 光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫, 肝胰腺等组织中也未分离到致病菌; 采用 PCR 方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1, MCDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus, SSRV) 蟹类常见病原 PCR 检测, 结果均为阴性; 病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体; 超薄切片电镜观察显示: 病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒, 粒子直径 150 nm 左右, 与已报道的十足目虹彩病毒 1 (decapoda iridescent virus 1, DIV1)形态特征相似。采用特异性套式 PCR 检测方法对患病蟹组织样品进行 DIV1 病原检测, 所有样本均扩增出 457 bp 和 129 bp 大小的目的片段。进一步根据 GenBank 中 DIV1 的主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物, 均能从病蟹样品中扩增出预期大小的 MCP 和 ATPase 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)区全长。将扩增获得的 MCP 和 ATPase 基因 ORF 区全长进行测序和同源序列比对分析, 进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的 MCP 和 ATPase 基因序列自然聚为一支, 判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为 DIV1。根据原位杂交探针设计原则, 以 DIV1 的 MCP 和 ATPase 基因的保守区域为靶位点分别设计探针, 通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况, 与电镜切片观察和套式 PCR 检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒 1 病诊断与防控提供参考。     

中华鳖弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定及药物敏感性试验

从患病中华鳖（Trionyx sinensis）内脏中分离到一株细菌（LCJY-002）。ATBExpression型微生物鉴定系统艋示：该菌为弗氏柠檬峻杆菌（Citrobcwter fundii）。16SrDNA分析得到1条长度为1456bp的核甘=酸序列（genBank登录号为KC691177）;Blast分析显示：该分离株与弗氏柠檬酸杆菌的同源性达99％,在系统发育树上与C．frgulldii聚为一支。鉴定结果确认：菌株LCJY-002为弗氏柠檬酸杆菌。人工回归感染试验证文：该菌具有敛病性,PCR检测表明：分离的弗氏柠檬酸杆菌具有c屈毒力因子。药敏试验结果显爪：该菌对16种抗菌药物中的庆大霉素等7种药物敏感。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

Molecular and phenotypic characterization of Vibrio aestuarianus, a pathogen of the cultured tongue sole, Cynoglossus semilaevis Günther

Studies were conducted to determine the cause of high mortalities of cultured half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis. Gross signs of disease included loss of appetite, erratic swimming, and haemorrhages on the head, opercula and base of fins, dorsal fin rot, swollen abdomen filled with ascitic fluid and herniation of the intestine. Histological examination of the liver showed focal areas of necrosis and extensive haemorrhages. Virtually pure, dense bacterial cultures were obtained from liver, kidney and spleen tissues, and high pathogenicity of the isolates to tongue sole was confirmed. The phenotypic characteristics of the isolates including morphological, physiological and biochemical characteristics were determined. The 16S rRNA and gyrB genes of the isolates were sequenced, and the phylogenetic trees representing genetic relatedness between the isolate and publicly available 16S rRNA and gyrB gene sequences from GenBank were constructed. The results confirmed that the diseased tongue soles were infected with Vibrio aestuarianus. The sequenced 16S rRNA gene of strain TS1 (GenBank Accession No. GQ372983) was 1446bp, the gyrB gene of strain TS1 (GenBank Accession No. GQ372984) was 1200bp and the two genes exhibited high similarity (98~99%) to those of V. aestuarianus from GenBank. In addition, the activities of extracellular enzymes and haemolysin were also studied; the results showed that the isolates produced beta haemolysis on rabbit blood agar, lecithinase, proteinase, DNase and lipase, but gelatinase was not produced.     

龙胆石斑鱼源美人鱼发光杆菌的生物学特性与系统发育学分析

对从1尾病死的观赏用龙胆石斑鱼Epinephelus lanceolatus L.中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等较系统的表观生物学性状鉴定。同时，测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明，供试两株纯培养菌（编号：HQ061227-1、HQ061227-2）为发光杆菌属Photobacterium（Beijerinck 1889）的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种P.damselae subsp.damselae（Love et al.1982；Smith et al.1991），用HQ061227-1株作为代表菌株的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区）为1469bp（GenBank登录号：EF635307），与GenBank数据库中美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的同源性在99%。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等32种敏感，对氨苄青霉素低敏。     

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。     

矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立

取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。