凡纳滨对虾28.5kD血蓝蛋白的降解新片段

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性且可以产生免疫学活性降解片段的多功能蛋白。为了探索血蓝蛋白新的降解片段，本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 为研究对象，采用比较蛋白质学技术分析对虾感染病原菌后血清蛋白质组的变化。结果发现，对虾感染副溶血弧菌(V     

凡纳滨对虾血清中直接与病原菌相结合的主要蛋白的鉴定

以凡纳滨对虾为研究对象,将其血清分别与溶藻酸弧菌,哈维氏弧菌,嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌等4种病原菌孵育,采用亲和蛋白质组学和Western-blotting等分子生物学方法纯化、鉴定和确证其中可与病原菌直接结合的蛋白.结果发现,与对照组相比4种病原菌与虾血清孵育5 h后均可与对虾血清中分子质量约为75 000 (p75) 的蛋白相结合,而孵育15 h后既可与p75相结合,还可与分子质量约为77 000 (p77) 的蛋白以及0～4种不同分子质量的蛋白相结合.经MALDI-TOF/MS分析和Mascot搜索引擎检索,p75和p77蛋白分别与凡纳滨对虾中分子质量约为75 000、77 000的2个血蓝蛋白亚基具有显著一致性.尤其是p75蛋白还可与兔抗血蓝蛋白75 000亚基抗体发生特异性结合.由此推断,凡纳滨对虾血清中与病原菌直接结合的主要蛋白为血蓝蛋白,提示血蓝蛋白全蛋白可能具有抗菌活性.     

与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌有关的6.0 kD 血蓝蛋白降解肽段

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用人工感染、Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、MALDI-TOF/TOF、抑菌实验等方法对血蓝蛋白小分子降解肽段进行研究。结果发现,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)刺激对虾24 h后,与对照组相比,其血淋巴中新出现5个分子量为6.0~31.0 k D的与兔抗血蓝蛋白抗体呈阳性的小分子条带。其中,分子量为6.0 k D的a条带(命名为HMCp6肽段)与凡纳滨对虾血蓝蛋白具有高度同源性,对副溶血弧菌具有明显的抑菌活性,与对照组相比,存在极显著性差异(P0.01)。由此说明,HMCp6应该是对虾感染副溶血弧菌后所产生的一种新的小分子降解肽段,推测其在对虾抗感染防御中发挥重要作用。     

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段的免疫调控活性

以源于血蓝蛋白化学合成肽段B1为研究对象,运用蛋白质组学、分子生物学等策略分析其对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的免疫调控活性。结果显示,与对照组比,对虾在受到肽段B1刺激后,血浆中2条分子量分别为65 kD和35 kD的蛋白条带(分别命名为p65和p35)表达水平显著上调。经质谱和Western blot鉴定, p65、p35与包括对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白、葡聚糖模式识别脂蛋白、血蓝蛋白等在内的13个蛋白具有高度同源性,其中p65与兔抗血蓝蛋白抗体呈明显的阳性反应。实时荧光定量PCR检测显示,肽段B1刺激对虾24 h后, 5个质谱鉴定免疫相关基因:血蓝蛋白大亚基、血蓝蛋白小亚基、谷氨酰胺转氨酶、α2巨球蛋白亚型2、葡聚糖模式识别脂蛋白在肝胰腺、鳃和血细胞等组织中mRNA的表达水平显著性(P0.05)或极显著性(P0.01)上调。由此推测,源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段B1对包括血蓝蛋白在内的多种免疫因子的表达具有一定的调控作用。     

注射磷脂酰丝氨酸对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活性的影响

为研究磷脂酰丝氨酸(PS)对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活性的影响,并探讨PS激活凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的机制,实验采用5、10和20μg/mL 3个PS浓度对凡纳滨对虾尾节肌肉进行注射,注射量为50μL,对照组注射生理盐水,各处理组设3个平行组,取样时间为0、6、12、24、36、48和60 h,分别测定了血浆血蓝蛋白含量,肝胰脏血蓝蛋白p75、p77亚基和mRNA的表达以及血浆血蓝蛋白酚氧化酶活性。结果显示:与对照组相比,血蓝蛋白含量在6 h内略有下降,6～36 h内呈峰值变化,24 h时达到最大值(P<0.05);血蓝蛋白亚基p75、p77和mRNA表达在0～36 h内呈峰值变化,12 h时达到最大值(P<0.05);血蓝蛋白酚氧化酶活性在36 h内呈峰值变化,12 h时达到最大值(P<0.05)。研究表明,PS能够激活凡纳滨对虾血蓝蛋白的酚氧化酶活性,表现出明显的时间剂量效应,同时在短时间内引起血蓝蛋白含量下降,随后机体启动血蓝蛋白的合成机制,证实PS是凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的激活因子,为对虾血蓝蛋白免疫活性的研究奠定了理论基础。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性

以凡纳滨对虾（Litopenaeaus vannarnei）为研究对象，运用亲和层析、PAGE、SDS-PAGE、Western-blotting和细菌凝集实验等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性。结果发现，血蓝蛋白对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水气单胞菌（Agromona hydrophila）和金黄色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）等6种虾类致病菌具有凝集活性，其凝集活性大小为0．27-1．08mg／L，其中对副溶血弧菌和溶藻酸弧菌凝集活性最大，是哈维氏弧菌的4倍。在此基础之上，选取α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨糖、蔗糖、麦芽糖、α-D-乳糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸等9种糖考察其对血蓝蛋白细菌凝集活性的影响。结果显示，血蓝蛋白的细菌凝集活性可被α-D-葡萄糖和N-乙酰神经氨酸所部分抑制和全部抑制，其最低抑制浓度范围为50～100mmol／L。由此推测，血蓝蛋白确实具有细菌凝集活性，这对进一步研究血蓝蛋白的抗菌机理具有重要意义。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白与人红细胞的作用靶位

采用亲和层析、SDS-PAGE、Far-Western-blotting、MALDI-TOF/MS等亲和蛋白质组学方法,发现凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白可与人红细胞膜上一种分子量为27 kD的膜蛋白发生特异性结合,经Mascot搜索引擎检索该蛋白与人红细胞膜蛋白——硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase)具有高度同源性。继而运用生物信息学技术对其相互作用进行分析,结果显示,硫氧还蛋白过氧化物酶与血蓝蛋白在三维结构水平可发生特异性的对接,且其结合位点呈现"锁钥模型"。由此推测,硫氧还蛋白过氧化物酶可能为对虾血蓝蛋白与人红细胞结合靶位之一,所获研究结果为进一步揭示血蓝蛋白的凝血、溶血作用机制等奠定了良好的基础。     

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性

选用黑曲霉(Aspergillus niger)为研究材料,采用滤纸片法、显微观察和电镜分析等方法探索12种源于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性。结果发现,6种合成肽段(B2、B10、B13、B14、S7和S9)在80μg/mL时能不同程度地抑制黑曲霉的生长,抑制率为30%~100%,其中,S7和B10抑制效果最佳。在此基础上,进一步选用B10分析其对黑曲霉孢子数目和形态的影响。结果显示,B10不仅可以明显延迟黑曲霉孢子的生长,而且还可以显著抑制孢子囊的发育。由此推测,对虾血蓝蛋白可能可以降解产生具有抗黑曲霉活性的功能性肽段,这对进一步阐明对虾血蓝蛋白功能性降解肽段的免疫学活性及其作用机制具有重要价值。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白酚氧化酶活性的研究

试验结果表明,凡纳滨对虾血蓝蛋白在胰蛋白酶诱导下可表现出一定的酚氧化酶活性,与对照组相比,其酚氧化酶活力单位显著上升。同时,其活性可被D-半乳糖、α-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸不同程度地抑制,其抑制率分别为67%、100%、33%、33%、67%和100%。血蓝蛋白与胰蛋白酶孵育后经SDS-PAGE分析和L-Dopa显色,其75 kDa单体呈明显的棕褐色,添加抑制剂N-乙酰神经氨酸之后,其显色强度显著减弱。由此进一步证实凡纳滨对虾血蓝蛋白在胰蛋白酶诱导下确实具有酚氧化酶活性,其活性可被不同的糖所抑制,其发挥活性的单体为75 kDa单体。     

对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。