日本沼虾过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

利用cDNA末端快速克隆方法获得了青虾(Macrobrachium nipponense)的过氧化物还原酶基因(Prx)全长cDNA序列。该基因cDNA全长878 bp, 包括72 bp的5′末端非翻译区, 594 bp的开放阅读框(ORF), 212 bp的3′末端非翻译区, 开放阅读框编码198个氨基酸。氨基酸相似度比对显示, 所分离的青虾过氧化物还原酶基因包括两个半胱氨酸残基的区域“FYPLDFTFVCPTEI”和“GEVCPA”。系统进化树分析表明, 青虾过氧化物还原酶基因与南美白对虾(Litopenaeus vannamei)过氧化物还原酶聚在一起, 具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示, 过氧化物还原酶基因在青虾不同组织中均有表达, 其表达量由低到高依次为肠道、心脏、卵巢、肌肉、鳃、肝胰腺。使用荧光定量PCR检测青虾在低氧胁迫和复氧条件下肝胰腺中的过氧化物还原酶基因mRNA的时空表达情况, 结果显示, 与对照组相比, 实验组青虾过氧化物还原酶在肝胰腺和鳃组织中的表达量分别在低氧胁迫12~24 h 和复氧6 h出现了3次明显上调, 由此推测过氧化物还原酶基因参与低氧应激分子过程。本研究结果可为进一步了解青虾低氧应激分子机制提供参考。

     

低盐度和不同硫酸铜浓度对银鲳鳃离子调节酶和肝抗氧化功能的影响

开展银鲳(Pampus argenteus)试养海域的盐度易随气候降低, 且受到一定程度Cu等重金属污染, 研究低盐条件下硫酸铜对银鲳的影响十分必要。本实验首先进行银鲳幼鱼低盐度适应, 将盐度以4的幅度从24逐步降低至12。稳定后进行硫酸铜胁迫, 在盐度12下CuSO₄·5H₂O浓度梯度设为0、0.1、0.3、0.5 mg·L^–1, 盐度24下CuSO₄·5H₂O浓度梯度设为0、0.5 mg·L^–1, 胁迫持续144 h。通过检测两种鳃离子调节酶: Na⁺/K⁺-ATP酶(NKA)和V-H⁺-ATP酶(VHA), 以及3种肝抗氧化活性物质－还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT), 探究低盐条件下铜离子对银鲳幼鱼上述指标的影响。结果显示, 盐度逐步降低后, NKA与VHA活力呈上升后下降的变化, 之后NKA活力随硫酸铜浓度增加而减弱; VHA活力加入硫酸铜后都出现显著下降, 其中CuSO₄·5H₂O 0.3 mg·L^–1与0.5 mg·L^–1组在72 h时下降更为明显; 盐度24硫酸铜组NKA和VHA活力都在24 h时增强而后减弱。GSH含量和SOD活力在盐度降低时出现跃升, CAT活力则呈波动变化, 加入硫酸铜后, 0.3 mg·L^–1与0.5 mg·L^–1组GSH含量持续下降后显著上升而后回落; 各硫酸铜组SOD活力都出现增强后回落的变化; 0.3 mg·L^–1与0.5 mg·L^–1组CAT活力在72 h有显著增强。本实验表明, 铜离子对NKA与VHA有抑制作用, 盐度降低时其作用更强; GSH、SOD和CAT的变化能反映低盐度和铜离子对银鲳的伤害程度。银鲳对水体铜离子有一定的抗性, 但在盐度降低等环境变化时, 应当密切注意水体中铜等重金属浓度。

     

NaCl盐度和NaHCO3碱度对鲤、鲫和大鳞鲃的精子活力及其受精率的影响

研究了不同NaCl盐度(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)和NaHCO₃碱度(0 mmol/L、10.00 mmol/L、15.85 mmol/L、25.12 mmol/L、39.81 mmol/L、63.10 mmol/L)对松浦镜鲤(Cynipus carpio)、方正鲫(Carassius auratus gibelio)和大鳞鲃(Barbus capito)精子活力及其受精率的影响。结果表明: 1) 在盐度为4时, 方正鲫和大鳞鲃精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命最长, 方正鲫分别为(90.11±9.03) s、(126.34±13.90) s和(154.27±11.36) s; 大鳞鲃分别为(48.91±1.43) s、(62.19±4.28) s和(90.68±4.46) s。在盐度为5时松浦镜鲤精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命最长, 分别为(72.44±9.42) s、(102.16±8.82) s和(206.99±6.65) s。2) 当盐度达到8以上时, 3种鱼的精子激活将受到抑制; 盐度大于10时, 方正鲫和大鳞鲃精子死亡; 盐度大于11时, 松浦镜鲤精子死亡。3) 在碱度为15.83 mmol/L时, 3种鱼的精子激烈运动时间、快速运动时间和寿命均最长, 且显著高于其他碱度条件下的精子活力(P<0.05)。4) 在盐度为1时, 方正鲫和大鳞鲃受精率达到最高分别为63.0%和68.0%, 在盐度为3时, 松浦镜鲤受精率达到最高为72.3%, 当盐度大于3时, 受精率开始呈明显下降趋势。碱度为10.00 mmol/L时, 3种鱼的受精率均最高, 分别为75.4%、54.0%和66.0%。本实验旨在通过测定不同NaCl盐度、NaHCO₃碱度条件下3种鱼类精子的活力和受精率所受的影响, 为北方地区碳酸型盐碱水域的渔业开发利用提供基础资料。 

     

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化

以福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH), 通过腹腔注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus), 分别于免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品, 进行大鲵外周血液的血细胞计数与白细胞组成分析, 测定吞噬细胞的吞噬活性以及血清中和抗体效价, 于免疫28 d后进行攻毒感染试验。结果表明, 与对照组相比, 在免疫后第4、7、14和第21天, 免疫大鲵外周血中血细胞数量显著增加, 其中, 红细胞和白细胞数量均于第4天达峰值, 分别为7.83×10⁷个/mL和6.74×10⁶个/mL; 嗜中性粒细胞百分比也在第4天达峰值, 为28.60%, 单核细胞百分比在第7天达峰值, 为10.53%; 吞噬细胞活性显著提高, 且吞噬百分比和吞噬指数均在第4天达到最高值, 分别为34.09%和3.73。随后, 淋巴细胞百分比和中和抗体效价显著增加, 均在第21天达峰值, 分别为75.30%和1︰426.67。攻毒感染实验结果表明, 免疫组的相对免疫保护率为69.23%。由此可见, F-AH免疫原能够通过促进血细胞数量的增加、吞噬细胞吞噬活性增强以及特异性抗体的产生等方式提高大鲵的免疫保护力。

     

斜带石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)杂交子代仔、稚鱼的异速生长

应用实验生态学的方法研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)(♀)×鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)(♂)杂交子代(青龙斑)仔、稚鱼阶段的生长模式。利用Q-Capture Pro 6软件对仔、稚鱼(0~28日龄)的全长、肛前长、体高、头长、眼径、口径、第二背鳍棘、腹鳍棘、胸鳍、臀鳍和尾鳍等11个可量性状进行拍照和测量。研究表明青龙斑全长的生长可分为3个阶段, 不同阶段生长速率存在显著差异(P<0.05)。各功能器官均表现为异速生长。在11个可量性状中, 肛前长为等速生长, 头长和体高的生长由正异速生长分别转变为等速生长和负异速生长; 头部器官(口径和眼径)生长在20 ~22日龄时出现拐点, 拐点后分别转变为等速生长和负异速生长; 运动器官在拐点前均为正异速生长, 除臀鳍外, 其他各鳍的生长均存在不同的拐点。通过对青龙斑仔、稚鱼异速生长的研究, 发现在早期发育过程中, 有关摄食、感觉、运动等功能器官得到优先发育。在人工繁殖苗种的培育中, 可根据青龙斑重要器官发育的优先性, 创造有利的外部环境, 提高苗种的成活率。

     

肌醇对哲罗鲑生长性能、体成分及消化酶活性的影响

为了探讨肌醇对哲罗鲑(Hucho taimen)生长性能、体成分及消化酶活性的影响, 以鱼粉、明胶和酪蛋白为蛋白源配制肌醇含量为99.8(不添加肌醇)、199.8、299.8、499.8、699.8、899.8和5 099.8 mg/kg的7种饲料, 分别投喂7个处理组, 每组3个重复, 每重复30尾鱼, 进行为期56 d的饲养实验。结果表明, 投喂肌醇含量为499.8 mg/kg饲料组的增重率最大, 且与添加量低于299.8 mg/kg的3个饲料组差异显著(P<0.05)。饲料系数在499.8 mg/kg饲料组最低, 在5 099.8 mg/kg饲料组最高, 两组间差异显著(P<0.05)。肌醇含量为499.8~899.8 mg/kg饲料组的特定生长率显著高于99.8~299.8 mg/kg及5 099.8 mg/kg饲料组(P<0.05)。肌肉中水分、粗脂肪和粗蛋白各组间差异不显著(P>0.05), 肝淀粉酶、幽门盲囊脂肪酶活性各组间差异不显著(P>0.05)。肠道蛋白酶活性在肌醇含量为199.8~499.8 mg/kg饲料组较高, 显著高于其他组(P<0.05), 脂肪酶活性在299.8~899.8 mg/kg饲料组高于99.8 mg/kg饲料组(P<0.05)。由此得出, 饲料中适量添加肌醇可提高哲罗鲑的生长性能及消化酶活性; 肌醇含量过低时哲罗鲑增重率、消化酶活性均较低; 肌醇含量过高时哲罗鲑特定增长率、消化酶活性较低, 饲料系数较高; 以增重率为指标由折线回归模型分析得出, 肌醇的最适含量为536.6 mg/kg饲料。

     

烟台近海3种贝类中呈味核苷酸和氨基酸的测定及比较分析

对水产品中呈味核苷酸和氨基酸的高效液相色谱检测方法进行了优化, 并对烟台近海长牡蛎(Ostrea gigas)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和中国蛤蜊(Mactra chinensis)3种贝类中呈味核苷酸和氨基酸的含量进行了比较分析, 从而为开发贝类复合调味料提供科学依据。以纯水提取呈味物质, 采用DABS-Cl柱前衍生反相高效液相色谱法测定游离氨基酸, 流动相为17 mmoL/L柠檬酸溶液(pH 6.4, 含4%DMF)和乙腈溶液(含4%DMF), 梯度洗脱, 检测波长436 nm。反相离子对色谱法测定呈味核苷酸, pH 4.5的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液为流动相, 磷酸二氢钾溶液内含5 mmoL/L四甲基氢氧化氨(TMAOH), 梯度洗脱, 检测波长254 nm。方法加标回收率为90.2%~108%, 相对标准偏差(RSD)为0.7%~7.1%。准确度、精密度均满足分析要求。测定结果显示: 长牡蛎中牛磺酸、丙氨酸和谷氨酸含量较高, 栉孔扇贝中甘氨酸、牛磺酸和丙氨酸含量较高, 中国蛤蜊含有较多的甘氨酸、牛磺酸和丙氨酸; 3种贝类中, 丙氨酸、谷氨酸的TAV均大于1, 栉孔扇贝和中国蛤蜊中, 甘氨酸的TAV大于1, 对呈味具有显著贡献。呈味核苷酸中, 长牡蛎中IMP含量最高, 占总呈味核苷酸的80%, 其次是GMP。中国蛤蜊中AMP含量最高, 其次是IMP。而栉孔扇贝中仅检测到IMP。3种贝类中呈味核苷酸含量虽然都较低, TAV未超过1, 但核苷酸之间、核苷酸和氨基酸之间的协同增效作用, 会对贝类的呈味产生重要影响。本研究通过对烟台近海3种贝类中各类鲜味物质和多种辅助呈味物质的含量、比例关系及其相互作用规律进行探讨, 旨在为充分利用贝类营养氨基本作为复合调味料及其功能性开发和评价提供科学依据。

     

维生素E对高脂饲料养殖大菱鲆生长、脂类代谢和抗氧化性能的影响

选用750尾初体质量为(114.2 ± 6.5) g的大菱鲆 (Scophthalmus maximus L.), 随机分成5组, 每组3个重复, 每重复50尾鱼, 分别投喂在高脂基础饲料中添加0(D-0)、120 (D-120)、240(D-240)、480 (D-480)和960 mg/kg (D-960) 的DL-α-生育酚醋酸酯5种试验饲料养殖110 d, 考察维生素E(VE)对高脂饲料养殖大菱鲆生长、脂类代谢和抗氧化性能的影响。结果表明, D-240组大菱鲆末均质量最高, 且显著高于D-0组(对照组)(P<0.05), 与其他组差异不显著(P>0.05); D-120组和D-240组饲料系数显著低于D-0组(P<0.05), 但蛋白质效率显著高于D-0组(P<0.05)。D-0组和D-960组血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和谷丙转氨酶显著高于其他各组(P<0.05), 而D-0组和D-960组高密度脂蛋白胆固醇则显著低于其他各组(P<0.05); 随着饲料VE添加水平的增加, 大菱鲆肝脂蛋白脂酶(LPL)活性有降低的趋势; 脂肪酸合成酶(FAS)活性, 有先增加后降低的趋势。大菱鲆肝总抗氧化酶、超级氧化歧化酶和过氧化氢酶活性, 均随VE添加水平的升高有先升高后下降的趋势, 而丙二醛含量的变化趋势则相反; 随着饲料VE水平的增加, 大菱鲆肝VE积累量有显著升高的趋势(P<0.05), 肌肉VE的积累量先升高后恒定在一个水平。综上所述, 在高脂饲料中添加适量的维生素E (有效含量124~243 mg/kg) 能改善大菱鲆生长性能、饲料利用效率、鱼肝体指数、脏体指数, 调节和改善血脂代谢, 可调控机体脂肪代谢酶活性, 提高机体组织VE积累量和肝抗氧化功能。本研究旨在通过考察添加不同水平的VE对高脂胁迫下大菱鲆生长、脂类代谢酶、抗氧化能力的影响, 为VE在高脂胁迫下的合理使用及以VE营养调控鱼类脂肪代谢和改善抗氧化功能提供参考依据。

     

大菱鲆选育家系抗鳗弧菌性能

基于家系选育技术开展了大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌病选育研究, 从2010年构建的37个选育二代家系中选择成活率高的30个家系进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染实验, 开展对鳗弧菌的抗病性研究。结果表明, 不同家系间抗鳗弧菌感染能力存在着显著差异(P＜0.05); 30个家系中, 鳗弧菌感染后, 12个家系的存活率达到65% 以上, 其余家系的存活率则低于65%; 通过bCOX回归分析, 计算各家系的优势比, 优势比最高的5个家系的存活率达到65% 以上; 对各家系的成活率、优势比和死亡历时差4项指标进行聚类分析, 优势比最高且存活率达到65% 以上的5个家系聚为一类。综合感染家系的高成活率、高优势比以及聚类分析的结果, 选育出5个抗病力较强的优良家系。选育出的抗病力较强的家系可做为抗鳗弧菌选育的核心育种群体, 为抗鳗弧菌病的传代选育奠定良好的基础。

     

鲢小清蛋白的cDNA克隆及在大肠杆菌中的原核表达

以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板, 利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增, 克隆得到β小清蛋白两种不同亚型, 即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a (+)表达载体, 并在大肠杆菌[E.coli BL21 (DE3)]中诱导表达。结果表明, 经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示, 目的蛋白的分子量约为13 kD, 与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni²⁺亲和层析柱对重组蛋白进行纯化, 得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot 鉴定, 重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ均能与抗鲢小清蛋白单克隆抗体反应。本研究为进一步分析小清蛋白的结构与致敏性的关系提供了重要的基础。

     

哺乳动物干细胞的研究进展

介绍了干细胞的概念和分类,综述了哺乳动物胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的分离培养、生物学特性、定向诱导分化以及几种重要的成体干细胞。讨论了干细胞的应用和存在的问题。     

暗纹东方鲀血细胞发生的观察

通过对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)血液涂片及头肾、体肾、脾脏和肝脏四种脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过三个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。实验对不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并对暗纹东方鲀血细胞的发生过程做了初步探讨。实验结果表明暗纹东方鲀血细胞的发育主要在头肾和体肾,肝脏印片未观察到原始造血细胞,提示肝脏可能不是暗纹东方鲀的造血器官。     

紫外辐射诱导草鱼肾脏细胞系（CIK）的程序性死亡

本文报道研究紫外辐射对离体培养的草鱼肾脏细胞系(CIK)的影响。实验结果显示,在距离15W紫外灯40cm下照射草鱼的CIK细胞3min后,CIK细胞核即产生固缩、碎裂现象,琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯形带,流式细胞仪检测发现有亚G1峰产生。结果表明,短时间的紫外辐射即可诱导CIK细胞发生细胞程序性死亡。     

淡水石斑鱼血细胞发生的观察

通过对淡水石斑鱼血涂片及头肾、肾、脾和肝脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过3个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。试验对脏器中不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并进行了分类统计。试验结果表明头肾、肾和脾是淡水石斑的主要造血器官,肝组织印片上未观察到原始阶段血细胞,提示肝脏不是淡水石斑鱼的造血器官。     

锌和氨氮对对虾肝胰脏的毒性作用

本文研究了中国对虾经锌和氨氮的毒性作用后肝胰脏内部结构发生的变化和损伤。结果表明,当锌和氨氮的不同浓度试验液对对虾经不同时间的中毒试验后,构成对虾肝胰脏肝小管的细胞组成、肝小管结构等发生不同程度的变化和损伤。在低浓度的锌和氨氮试验液的毒性作用下,构成肝小管管壁的分泌细胞增多,吸收细胞减少,且分泌细胞内形成较多的分泌小泡;当经高浓度的试验液作用后,不但肝小管管壁内的吸收细胞减少,分泌细胞增多及产生大量分泌小泡,而且因分泌细胞的破裂解体导致部分肝小管损伤或破坏。文中并就对虾肝胰脏在锌和氨氮的毒性作用下发生的变化与肝胰脏自身的解毒作用机理进行了初步的探讨。     

鲤鱼血淋巴细胞培养及染色体制备条件探索

从鲤鱼侧线鳞处静脉采血于含有肝素的一次性注射器中，采用RPMI1640全培养基进行体外淋巴细胞培养。通过对采血后细胞培养时间、秋水仙素浓度及加入时间、低渗时间及温度等条件的摸索，建立了较成熟的培养鱼类血淋巴细胞的实验方法。     

脊椎动物源细胞因子对合浦珠母贝外套膜细胞培养及其矿化功能的影响

筛选出能促进合浦珠母贝外套膜细胞培养及矿化功能的细胞因子,以作为优化本物种细胞培养基的参考,挑选三龄合浦珠母贝,获取其外套膜进行原代细胞培养。向各实验组细胞培养基中分别添加表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长添加剂(ECGS)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过比较细胞活性、贴壁能力、迁移能力和4种基质蛋白基因(pif80、n16、msi7及accbp)表达水平的变化,来评判这些因子对细胞培养及细胞矿化功能的影响。结果显示:(1)EGF能显著提高原代培养细胞的活性、贴壁能力和迁移能力,并促进pif80、n16和accbp基因的表达;(2)ECGS能增强细胞的贴壁能力和迁移能力,并大幅提高pif80、n16和msi7基因的表达水平;(3)IGF-1能显著增强细胞活性、贴壁能力、迁移能力和msi7的基因表达水平,但对pif80、n16和accbp基因的表达有一定抑制作用;(4)碱性成纤维细胞生长因子能增强细胞的活性及贴壁能力,并显著提升pif80、n16和accbp基因的表达水平。研究表明,脊椎动物源细胞因子具有延长细胞培养时间、增强细胞活性及促进矿化相关基因表达的作用,能够用于优化合浦珠母贝外套膜细胞的培养基。     

Cytochrome oxidase gene sequencing reveals channel catfish ovary cell line is contaminated with brown bullhead cells

The channel catfish (Ictalurus punctatus, Rafinesque) ovary (CCO) cell line is the standard cell line used for channel catfish diagnostics. Next‐gen sequencing studies of a virus cultured in the CCO cells revealed mitochondrial sequences matching those of brown bullhead (Ameiurus nebulosus, Lesueur). Therefore, we systematically performed partial cytochrome oxidase 1 gene sequencing of several sources of the CCO cell line and all matched the brown bullhead and not the channel catfish.     

在斑马鱼仔鱼脑部异体移植胚胎细胞的尝试

为建立斑马鱼(Danio rerio)脑部细胞移植模型,先用红色荧光染料标记供体胚胎细胞,再移植细胞到AB品系和两种转基因斑马鱼仔鱼脑部。荧光显微镜和组织学切片观察发现移植细胞沿组织或细胞间隙而不是通过血管向周围组织扩散,但细胞增殖分化不明显。在细胞移植24 h后,脑部组织学结构与对照组无明显差别。带有白血病基因的胚胎细胞在AB仔鱼的脑部没有产生肿瘤样增生和转移。相比之下,正常胚胎细胞在白血病模型的仔鱼脑部非白血病细胞聚集区出现较多增殖和迁移。这些结果提示脑局部微环境不支持移植细胞的增殖分化;细胞移植只能弥补局部细胞的空疏而不能用作细胞替代治疗。