中华鲟子二代仔鱼对光照强度的趋性行为

设计4种点光源(100 lx、320 lx、960 lx、1 920 lx)光照模式, 以黑暗和面光源(68 lx)模式为对照, 以30 min为实验周期, 对中华鲟(Acipenser sinensis)子二代仔、幼鱼(5~29日龄)的趋光行为进行观察和统计分析。结果表明, 仔鱼处于平游期(5~8日龄)时, 点光源光照条件下活动鱼苗的趋光率显著高于对照组(黑暗环境和面光源)(P<0.05), 而且点光源光照条件下活动鱼苗的趋光率随着光照强度的增强而增加, 并在1 920 lx与100 lx和320 lx间存在显著性差异(P<0.05)。平游期仔鱼的趋光性最为明显, 在设定的4种点光源光照强度中, 在100 lx的低强度光照下趋光性最强, 在960 lx光照强度下趋光性最弱, 且二者存在显著性差异(P<0.05); 中华鲟子二代进入沉底期以后, 光照的影响作用明显减弱, 仔鱼基本失去趋光性。研究表明, 中华鲟子二代仔鱼具有平游期趋光性最强、趋弱光和沉底之后基本失去趋光性等行为特点, 这种趋光行为与野生中华鲟仔鱼基本一致。研究结果可为阐明中华鲟全人工繁殖后代生态适应性提供参考。

     

褶纹冠蚌防御素基因特征与表达

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)样本壳长(9.50±1.05) cm、壳高(6.45±0.81) cm, 暂养1周。40只随机分成试验组和对照组, 每组20只。用Trizol 法提取经诱导刺激后0、6、12、24、36、48 h的血液、外套膜、鳃、肝胰腺组织RNA, 构建褶纹冠蚌cDNA文库并从中获得防御素基因cDNA全长序列。结果表明, 褶纹冠蚌防御素序列全长为514 bp, 其中5’ UTR 有57 bp; 3’ UTR 有242 bp, 含有一个poly(A)尾; 开放阅读框长度为192 bp, 编码63个氨基酸组成的蛋白质, 该蛋白N端为1个由23个氨基酸构成的信号肽, 成熟肽由40个氨基酸组成, 理论等电点为8.72, 分子量为7.13 kD。三级结构预测显示其由一个 α 螺旋和两个 β 折叠片组成, 形成典型的CSαβ结构。通过注射10⁹ cell/mL 的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激褶纹冠蚌, 半定量分析PCR对褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃和肝胰腺组织的防御素基因表达, 结果表明, 诱导前防御素基因在外套膜组织中表达量最高, 约为血液和鳃的1.25倍, 肝胰腺次之。在诱导0、6、12、24、36、48 h后, 对照组的防御素基因表达量在血液和鳃中无明显变化, 而在外套膜和肝胰腺中则呈现先略有下降而后上升; 试验组防御素基因在血液中 12 h 时表达量最高, 随后略有下降, 而在外套膜、鳃和肝胰腺组织中表达量均在 0 h 时出现峰值, 而后呈现下降趋势; 外套膜和鳃的表达量分别在 24 h 和 36 h 略有上升。本研究通过分析褶纹冠蚌防御素基因全序列, 并利用嗜水气单胞菌对褶纹冠蚌进行注射感染, 探讨防御素基因的表达规律, 以期为防御素对贝类非特异性免疫的影响提供基础依据。

     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus, GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物, 以病毒全基因组RNA为模板, 通过对反应条件进行优化, 建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明, 本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增, 扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带, 反应体系中添加SYBR Green I 荧光染料后, 绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高, 其最低检测限为33 pg, 与常规RT-PCR方法相比较, 灵敏度高10倍, 且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高, 且不需昂贵仪器设备, 为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。

     

环境因子对瓦氏马尾藻生长及光合作用的影响

研究不同温度(10、15、20、25、30℃, 光照强度80 μmol穖^?穝^?, 盐度30)、光照强度(20、60、100、200、300 μmol穖^?穝^?, 培养温度20℃, 培养液盐度30)和盐度(盐度10、20、30、40和50, 培养温度20℃, 光照强度80 μmol穖^?穝^?)对瓦氏马尾藻(Sargassum vachellianum)生长、光合色素含量及光合放氧活性的影响。结果表明, 3种环境因子对瓦氏马尾藻生长、光合色素含量及光合放氧活性影响显著(P<0.05)。其中, 瓦氏马尾藻适宜生长条件为: 温度15~20℃, 最适温度为20℃; 光照强度20~60 μmol穖^?穝^?; 盐度20~40, 最适盐度为30。最高特定生长率达5.80%穌^?。温度高于25℃或光照强度大于200 μmol?/SPAN>m^?穝^?或盐度小于10或大于50藻体2两周后基本停止生长并出现发白、变软、腐烂现象。温度10~20℃、光照强度20~60 μmol穖^?穝^?、盐度20~40时较适宜瓦氏马尾藻光合色素的积累。温度20℃、光照强度100 μmol穖g^?穐^?、盐度30时瓦氏马尾藻的光合放氧活性最高, 最高值达258.50 μmol?/SPAN>m^?穝^?。与低光强相比高光强对瓦氏马尾藻光合放氧活性的抑制作用不明显。研究结果为瓦氏马尾藻的栽培和藻场修复提供了理论依据。

     

胭脂鱼听觉阈值研究

利用听性脑干反应技术, 研究了胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)的听觉阈值。通过插入皮下的电极记录了10尾胭脂鱼的短纯音听觉诱发电位。结果显示, 在系统最大声强下, 胭脂鱼的听频范围为100~5 000 Hz, 其中对100~2 000 Hz的声音敏感度较高, 最敏感的频率为800 Hz, 听觉阈值约为69.8 dB。随着声强的减小, 胭脂鱼的听性脑干反应波形最大, 振幅减小, 潜伏期延长。将10尾胭脂鱼的阈值平均, 得到了胭脂鱼的听性脑干反应听力图。胭脂鱼的听力图呈“U”形, 属于典型的动物听力曲线。研究胭脂鱼的听觉阈值对胭脂鱼物种保护具有重要意义, 同时可为评估噪声对胭脂鱼的影响提供数据支持。

     

福建省东山湾生态环境中滴滴涕(DDTs)的分布特征及风险评价

 根据2011年春季(5月)和夏季(8月)对东山湾生态环境的调查资料, 初步探讨了东山湾海水、沉积物和养殖贝类体中滴滴涕(DDTs)残留水平、分布趋势和组成特征, 并对东山湾生态环境中DDTs污染状况及其生态风险进行了评价。结果表明: (1)春季(5月)和夏季(8月)东山湾表层海水中DDTs质量浓度范围分别为ND~25.7 ng/L和ND~36.7 ng/L, 平均值分别为(6.08±3.02) ng/L和(16.30±4.78) ng/L; 底层海水中DDTs质量浓度范围分别为ND~30.6 ng/L和ND~36.7ng/L, 平均值分别为(7.75±2.07) ng/L和(13.30±5.12) ng/L, 总体上, 东山湾海水中DDTs浓度分布呈夏季高于春季、近岸高于远岸、由湾内向湾外下降的格局。与国内其他海湾相比, 东山湾海水中DDTs污染处于低水平状态, 但邻近漳江入海口海域的DS03站和DS11站可能有新的污染源输入。(2)东山湾表层沉积物中DDTs含量范围5.56~12.80 μg/kg, 平均值为(9.00±5.34) μg/kg, 总体上呈现由湾内向湾外下降之势, 东山湾表层沉积物中DDTs残留可能对生物产生负效应, 毒性风险为25%~75%。(3)东山湾海域养殖贝类DDTs的残留量在种类间存在一定的差异, 其DDTs含量范围在1.68~26.60 μg/kg, 平均值为15.70 μg/kg, 污染指数范围在0.007~2.660, 均值为1.580, 超标率达到71.4%, 超标倍数最高达1.66倍, 说明东山湾部分贝类受到DDTs的污染。

     

建鲤生长性状QTL区间及其与镜鲤同源性比对

以建鲤(Cyprinus carpio var. jian)F₁群体的94尾个体为材料, 利用254个微卫星标记构建了建鲤的遗传图谱, 并对体长、体高和体厚性状进行了QTL定位, 共检测到17个生长相关性状QTL, 分布在10个连锁群上, 解释表型变异为10.8%~35.2%。以相同的分子标记, 构建建鲤与镜鲤(Cyprinus carpio L.)的比较图谱, 分析了建鲤和镜鲤群体生长性状QTL的同源性关系。结果表明, 建鲤与镜鲤图谱具有广泛的共线性或同线性关系, 建鲤每个连锁群在镜鲤图谱中均找到了对应的同源连锁群, 其中建鲤10个生长性状QTL与镜鲤13个相同性状QTL具有同源性, 同源比例高达58.8%。同时发现, 建鲤QTL置信区间相对较大, 与之同源的镜鲤QTL置信区间较小, 通常位于建鲤QTL子区间内, 定位结果更精细。此外, 建鲤与镜鲤连锁群上都存在QTL的富集区域, 而这些富集区域常常存在于同源连锁群的共线性区域, 可作为标记辅助选择的重点区域。鲤通用QTL的发掘, 为分子标记辅助育种和更进一步的精细定位打下基础。

     

吉富罗非鱼成鱼胆碱的最适需要量

选用初始体质量为(220.00±8.34) g的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)360尾, 随机分成6组,每组3重复(每重复20尾), 于1 m×1 m×1.5 m池塘网箱中饲养。分别饲喂胆碱含量为97.80(对照组)、375.04、565.74、974.27、      1 409.81、1 824.35 mg/kg的半纯化饲料10周, 研究胆碱对吉富罗非鱼成鱼生长、饲料利用、鱼体营养组成、胆碱蓄积量及部分血液生化指标的影响。结果显示, 经过10周的饲喂, 饲料中添加胆碱可显著提高鱼体增重率、特定生长率和饲料效率(P<0.05); 降低肝脂肪含量(P<0.05), 提高肌肉脂肪含量(P<0.05); 显著升高肝胆碱蓄积量(P<0.05); 胆碱添加组血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-CHO)显著高于对照组(P<0.05), 并随饲料胆碱含量增加呈现升高的趋势; 肝甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-CHO)随着胆碱含量的增加而显著降低(P<0.05); 血清谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)均随着饲料胆碱含量的增大而显著降低(P<0.05)。结果表明, 饲料中添加适量的胆碱可以改善吉富罗非鱼成鱼的生长性能, 提高饲料利用效率, 降低肝脂肪含量, 促进肝脂肪转运; 对特定生长率进行回归分析, 得出吉富罗非鱼成鱼对饲料中胆碱的最低需要量为506.43 mg/kg, 而对肝胆碱蓄积量回归分析得出的需要量为981.38 mg/kg。

     

重组激活基因(RAGs)功能机制及其在鱼类早期发育中的作用

在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育过程中, BCR和TCR基因座(Igκ、Igλ、Igh、Tcrα、Tcrβ、Tcrγ、Tcrδ)的可变区(V)、多样区(D)、链接区(J)发生V(D)J重排, 该重排过程是在重组激活蛋白(RAG-1和RAG-2)的作用下完成的, V(D)J重排机制使机体拥有庞大的抗体库, 以应对自然界中多元的病原微生物。RAGs结构分为核心区和非核心区, 核心区域发挥着重要的基因片段酶切功能, 而非核心区域的九聚体序列(nonamer)、锌指等结构具有调节V(D)J重排的功能。RAGs的功能在转录水平、染色体水平以及蛋白水平受到严格的时间和空间调控, 以保证B/T细胞的正常发育。随着国内外学者对哺乳动物RAGs基因的结构与功能机制的深入研究, RAGs也在淡水鱼和海水鱼中有了越来越多的报道。由于RAGs的功能特点以及在进化过程中的稳定性, 其已成为研究鱼类免疫系统发育过程和系统进化的重要分子标记。本文在赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) RAGs研究的基础上探讨了RAGs定位鱼类免疫系统的发生过程, 旨在为鱼类人工繁殖技术的突破、鱼类疫苗的开发与研制以及鱼类免疫学研究等提供理论借鉴。

     

不同牙鲆群体遗传力和育种值分析

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗病群体(RS)、RS(♂)与从日本引进的日本群体(♀)交配建立的群体(RJ)、日本群体(♂)与RS(♀)交配建立的群体(JR)、以及韩国群体(KS)为基础群体, 通过随机交配建立牙鲆家系, 研究了4个群体作为亲本的育种性能。待所建立的家系生长至19月龄左右时, 测量家系生长性状, 包括全长和体质量, 测量所得数据用SPSS及DMU软件中的REML算法和BLUP方法进行分析。结果显示, 从表型参数可以看出KS(♂)×RJ(♀)杂交后代表现出明显的生长优势。19月龄牙鲆全长和体质量的遗传力分别为0.301、0.295, 都属于中等遗传力。因此, 牙鲆群体具有较好的遗传改良潜力。全长、体质量育种值与其表型值的相关系数分别为0.838和0.827, 且呈极显著相关(P<0.01), 表明个体育种值的预测结果具有较高的准确性。对父母本分别进行育种值比较可知, 父本中KS的育种值最高, 母本中RJ的育种值最高, 因此选用KS(♂)和RJ(♀)杂交可培育出生长迅速的牙鲆新品种。本研究通过比较4个资源群体牙鲆生长性状的育种性能, 并以此作为筛选优良亲本群体的重要依据, 旨在为牙鲆新品种的成功选育奠定理论基础, 同时为牙鲆的进一步遗传改良提供重要的科学依据。

     

传染性胰腺坏死病毒VP2COE蛋白单克隆抗体的制备及与初步应用

为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。     

Immunity induced by recombinant attenuated IHNV (infectious hematopoietic necrosis virus)‐GN438A expresses VP2 gene‐encoded IPNV (infectious pancreatic necrosis virus) against both pathogens in rainbow trout

Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) are important pathogens in rainbow trout farming worldwide. Their co‐infection is also common, which causes great economic loss in juvenile salmon species. Development of a universal virus vaccine providing broadly cross‐protective immunity will be of great importance. In this study, we generated two recombinant (r) virus (rIHNV‐N438A‐ΔNV‐EGFP and rIHNV‐N438A‐ΔNV‐VP2) replacing the NV gene of the backbone of rIHNV at the single point mutation at residue 438 with an efficient green fluorescent protein (EGFP) reporter gene and antigenic VP2 gene of IPNV. Meanwhile, we tested their efficacy against the wild‐type (wt) IHNV HLJ‐09 virus and IPNV serotype Sp virus challenge. The relative per cent survival rates of two recombinant viruses against (wt) IHNV HLJ‐09 virus challenge were 84.6% and 81.5%, respectively. Simultaneously, the relative per cent survival rate of rIHNV‐N438A‐ΔNV‐VP2 against IPNV serotype Sp virus challenge was 88.9%. It showed the two recombinant viruses had high protection rates and induced a high level of antibodies against IHNV or IPNV. Taken together, these results suggest the VP2 gene of IPNV can act as candidate gene for vaccine and attenuated multivalent live vaccines and molecular marker vaccines have potential application for viral vaccine.     

Betanodavirus: Dissection of the viral life cycle

Progressive research has been recently made in dissecting the molecular biology of Betanodavirus life cycle, the causative pathogen of viral encephalopathy and retinopathy in economic important marine fish species. Establishment of betanodavirus infectious clone allows the manipulation of virus genome for functional genomic study, which elucidates the biological event of the viral life cycle at molecular level. The betanodavirus strategizes its replication by expressing anti‐apoptosis/antinecrotic proteins to maintain the cell viability during early infection. Subsequently utilizes and controls the biological machinery of the infected cells for viral genome replication. Towards the late phase of infection, mass production of capsid protein for virion assembly induces the activation of host apoptosis pathway. It eventually leads to the cell lysis and death, which the lysis of cell contributes to the accomplishment of viral shedding that completes a viral life cycle. The recent efforts to dissect the entire betanodavirus life cycle are currently reviewed.     

Genetic analysis of infectious pancreatic necrosis virus from Scotland

Infectious pancreatic necrosis (IPN) is a highly contagious disease of young salmonid fish, and is one of the most serious economic diseases in aquaculture. In Scotland, an increase in IPN virus (IPNV) outbreaks in seawater Atlantic salmon, Salmo salar, has been reported in recent years. The aim of this study was to analyse the VP2 gene from recent IPNV isolates from Scotland, to determine whether there are epidemiological links between IPNV isolates from farms (13), wild fish (17) and the environment (6) in order to investigate potential wild and farmed fish interactions. Comparison of the nucleotide sequence of the VP2 gene revealed that 34 of 36 isolates were 97.1-100% similar and the deduced amino acid sequences showed 97-100% identity. Two isolates from wild fish exhibited the most divergence at 85-87.3% similarity to the other isolates at the nucleotide level and 88.2-90.8% identity at the deduced amino acid level. Phylogenetic analyses revealed that 34 of 36 of the isolates from Scotland were genetically closely related to the A2 (Sp) serotype of IPNV. The two wild isolates from seatrout, Salmo trutta, and flounder, Platichthys flesus, were most closely related to the European A5 (Te) serotype. This study represents a comprehensive IPNV phylogenetic study that indicates that there are closely related or identical isolates in circulation in the marine environment, which adds evidence that disease interactions between wild and farmed fish may occur. This type of analysis is a useful tool in the management and control of fish diseases because it can assist in the identification of epidemiological links and highlight potential risks to aquaculture.     

三种水生动物病毒感染鱼类细胞的扫描电镜观察

近年 ,从我国患病的水生动物中已发现和分离到不同的病毒病原[1,2 ] ,并通过透射电镜对部分水生动物病毒作了形态学研究 ,包括病毒的大小和形态结构、病毒在感染鱼类细胞内的复制和装配、病毒引起宿主细胞内超微病变及与细胞的相互作用等[3 -6] 。但对病毒引起宿主细胞表面病变的研究不多[7] ,尤其是借助扫描电镜对水生动物病毒进行深入观察与比较的报道就更少[8] 。在本实验室已确定鲤乳头瘤细胞 (Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉ,ＥＰＣ)、草鱼性腺细胞 (Ｇｒａｓｓｃａｒｐｏｖａｒｉｅｓ ,ＧＣＯ)和草鱼鳍条细…     

Molecular cloning of MDA5, phylogenetic analysis of RIG‐I‐like receptors (RLRs) and differential gene expression of RLRs,interferons and proinflammatory cytokines after in vitro challenge with IPNV,ISAV and SAV in the salmonid cell line TO

The RIG‐I receptors RIG‐I, MDA5 and LGP2 are involved in viral recognition, and they have different ligand specificity and recognize different viruses. Activation of RIG‐I‐like receptors (RLRs) leads to production of cytokines essential for antiviral immunity. In fish, most research has focused on interferons, and less is known about the production of proinflammatory cytokines during viral infections. In this study, we have cloned the full‐length MDA5 sequence in Atlantic salmon, and compared it with RIG‐I and LGP2. Further, the salmonid cell line TO was infected with three fish pathogenic viruses, infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), infectious salmon anaemia virus (ISAV) and salmonid alphavirus (SAV), and differential gene expression (DEG) analyses of RLRs, interferons (IFNa‐d) and proinflammatory cytokines (TNF‐α1, TNF‐α2, IL‐1β, IL‐6, IL‐12 p40s) were performed. The DEG analyses showed that the responses of proinflammatory cytokines in TO cells infected with IPNV and ISAV were profoundly different from SAV‐infected cells. In the two aforementioned, TNF‐α1 and TNF‐α2 were highly upregulated, while in SAV‐infected cells these cytokines were downregulated. Knowledge of virus recognition by the host and the immune responses during infection may help elucidate why and how some viruses can escape the immune system. Such knowledge is useful for the development of immune prophylactic measures.     

多重RT-PCR体系检测4种虾病毒的方法

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV 特异性扩增片段435 bp,IHHNV 特异性扩增片段301 bp 和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0.02和0.2 pg。病毒感染病料检测试验中,该检测体系的检测结果与单纯PCR的检测结果呈现出较好的吻合度。