大菱鲆T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)基因全长cDNA的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列.该序列包含193 bp的5'末端非编码区(5'UTR),1 506 bp的开放阅读框(ORF)和300 bp 3'UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸.系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方纯(Fugu rubripes)和黑青斑河纯(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近.在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-PCR表达分析.结果表明,大菱鲆LCK基因只在正常脾脏组织中表达;在用鳗弧菌感染12 h后,大菱鲆胚胎细胞LCK基因表达增强;在鳗弧菌感染的大菱鲆免疫组织中,只在脾脏中检测到LCK基因表达,鳗弧菌感染48 h后,LCK基因在脾脏中表达最强.这些结果表明,LCK基因在大菱鲆脾脏免疫应答中起着重要作用.     

大菱鲆脂质代谢相关基因PPARs的组织表达及其对高温胁迫的响应

为研究大菱鲆过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)的组织分布和高温胁迫下PPARs在肾脏中的表达情况。实验采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测PPARs基因3种亚型在大菱鲆不同组织中的表达情况以及高温胁迫下大菱鲆肾脏中PPARs的表达情况。qPCR结果显示,大菱鲆PPARs 3种亚型的组织分布存在显著差异。PPARα1和PPARα2在心脏中的表达量显著高于其他组织;PPARβ在大菱鲆的各个组织中普遍表达;PPARγ在大菱鲆的鳃中出现了显著性的高表达。大菱鲆肾脏中PPARs的mRNA水平随着温度升高呈现出不同的响应模式。PPARα随温度升高表达水平先显著降低,后有所升高;PPARβ的表达量在14、20、23和25℃时差异不显著,当温度升高至大菱鲆的致死温度28℃时,表达量出现了显著性的升高;PPARγ在14℃时表达水平很低,但随着温度的升高不断增加。研究表明,大菱鲆中存在PPARα、PPARβ和PPARγ3种亚型,而且三者可能以组织特异性的方式参与脂质代谢的调节,首次指出PPARs 3种亚型在温度胁迫中的表达变化,对PPARs的研究将推动鱼类脂代谢研究,揭示鱼类PPARs在脂质代谢调控以及响应逆境胁迫中的重要作用。     

水中Mn(Ⅱ)对大菱鲆幼鱼生长及碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响

水温14~16℃下,将初始体质量为(5.0±1.0)g的大菱鲆养殖在40L水体的水族箱中,研究在不同Mn(Ⅱ)质量浓度(0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10.24mg/L)下大菱鲆的生长及碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶的活性。结果表明,当水体中Mn(Ⅱ)质量浓度低于2.56mg/L时,鱼的生长较快,其中Mn(Ⅱ)质量浓度为0.64mg/L时生长最快;当Mn(Ⅱ)质量浓度低于0.64mg/L时,大菱鲆肝脏的碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性随着Mn(Ⅱ)质量浓度的提高而增加,当Mn(Ⅱ)质量浓度超过0.64mg/L时,碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶的活性急剧下降;0.64mg/L组的碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶的活力均较高,随着Mn(Ⅱ)质量浓度增加,碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶的活力先增后减;据剂量效应推测,0.64mg/L为Mn(Ⅱ)表现出毒性作用的临界质量浓度。     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。     

10种免疫相关基因在斜带石斑鱼组织中的表达分析

采用相对实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术,以β-肌动蛋白(β-actin)的表达量作为内参,对健康养殖斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)不同组织(头肾、心脏、肝脏、脾脏、鳃、肌肉、鳍、眼、肠道)中的10种免疫相关基因:免疫球蛋白(IgM)、CD4、MHCIIa、TCRβ、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90的mRNA表达量进行了研究。结果显示,10种免疫相关基因在斜带石斑鱼的10种组织中均有表达。其中体液免疫相关基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]在鳃中的表达量最高,在其他组织部位的表达量相对较少。细胞免疫相关基因(TCRβ、CD8a和MHCIa)也是在鳃中的表达量最高,在眼、肌肉、肝和肠的部位表达量相对较少。ISP16在鳃和肝中的表达量较高,在肌肉和肠中的表达量较低。Mx在鳃中的表达量较高,在肌肉和肠的表达量较低。TNFR14在眼的表达量较高,在肠的表达量较低。HSP90在鳃和肝中的表达量相对较高,在心和肌肉的表达量较低。     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

镉胁迫对泥鳅金属硫蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了不同浓度Cd2+(0、0.25、2.5 mg/L)胁迫24、48、72 h对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)肝脏和鳃中金属硫蛋白(MT)基因相对表达水平的影响。结果表明,泥鳅肝脏和鳃MT基因的表达对外源Cd2+胁迫所表现出的反应存在差异,肝脏比鳃更为敏感;Cd2+浓度越高,胁迫时间越长,则肝脏和鳃中MT基因的相对表达水平越高。在受到Cd2+胁迫时,肝脏和鳃中大量表达MT,可降低Cd2+对机体造成的损伤。泥鳅MT基因可以作为监测水环境中镉污染的生物标志物之一。     

施氏鲟促卵泡激素受体基因cDNA的克隆、表达及调控

为研究促卵泡激素受体基因(FSHR)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)性腺分化过程中的表达、分布及调控作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆得到施氏鲟促性腺激素(FSHR)基因的全长cDNA序列,并对其编码氨基酸序列的特征、基因表达及调控作用进行了分析。结果显示:施氏鲟FSHR基因的cDNA全长为2696 bp,编码661个氨基酸,属于含有信号肽、跨膜结构且分泌到细胞外的疏水性蛋白。氨基酸同源性及进化分析表明,施氏鲟与小体鲟(A.ruthenus)FSHR序列一致性最高,亲缘关系最近。PCR结果显示,FSHR mRNA的表达具有广泛性,各组织中均有表达,但在性腺、垂体中的表达量较高,显著高于其他组织中的表达量。LHRH-A注射实验显示:不同浓度组中,施氏鲟性腺组织中FSHR mRNA的表达量呈先升高后降低的变化趋势;与对照组相比,1μg/kg组在诱导3 d时性腺组织中FSHR mRNA的表达量达到最高,极显著高于3μg/kg和5μg/kg组。与性腺组织中FSHR mRNA表达模式不同,垂体中FSHR mRNA的表达呈升高后降低趋势,3μg/kg组在注射后第3天达最大值。综上结果表明,LHRH-A可通过调控FSHR的表达参与施氏鲟的早期性腺发育。     

诺氟沙星在大菱鲆体内药代动力学及残留消除规律

利用高效液相色谱法分别测定了单次和多次混饲口灌大菱鲆诺氟沙星(NFLX)后鱼体主要组织中的NFLX含量。通过MCP-KP药动学程序对NFLX在大菱鲆体内的药代动力学及残留消除规律进行了分析研究。结果表明,以30mg/kg的剂量单次混饲口灌大菱鲆,NFLX在大菱鲆体内的达峰时间(Tmax)为2h,血、鳃、肾脏、肝脏、肌肉的达峰浓度(Cmax)分别为:8.365、7.519、1.871、6.485和4.060μg/g;NFLX在组织中的消除半衰期(T1/2)由小到大依次为:肝脏8.18h<肌肉12.39h<鳃丝15.29h<血液23.22h<肾脏23.25h。连续5d以30mg/kg的剂量混饲口灌大菱鲆,消除半衰期(T1/2)由小到大依次为:肌肉74.88h<血液98.16h<肝脏186.43h<鳃192.12h<肾脏200.45h。以上研究表明,诺氟沙星在大菱鲆体内的吸收较为迅速,有利于疾病的预防和治疗用药。在组织中以肾脏中的残留最为显著。使用诺氟沙星进行大菱鲆疾病的预防和治疗时,至少停药30d后方可上市销售。     

低氧胁迫对鲢抗氧化酶活性及SODs基因表达的影响

为研究低氧胁迫对鲢(Hypophthalmichthys molitrix)不同组织抗氧化酶活力及对相关基因的影响,将体重(200±12.4) g的鲢放置于密闭水箱中,通过鱼体自发耗氧进行低氧处理,在常氧[溶氧为(6.42±0.3) mg/L]、浮头[溶氧为(0.76±0.03) mg/L]、半窒息[溶氧为(0.58±0.06) mg/L]和窒息[溶氧为(0.27±0.06) mg/L]时分析血液、鳃和肝脏组织中的抗氧化酶活性及超氧化物歧化酶基因(SODs)表达特征。结果显示:低氧胁迫过程中,血清过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力逐渐增加,CAT活力在半窒息时显著升高,GPX无显著变化,超氧化物歧化酶(SOD)活力相比其他组均显著降低;肝脏中SOD、CAT酶活力呈先升高后下降的趋势,在窒息组时酶活力显著降低,GPX无明显变化。肝脏中Cu/Zn-SOD mRNA表达量在浮头和窒息时相比于常氧组有显著差异,鳃中Cu/Zn-SOD表达量在低氧胁迫组均显著低于常氧组;Mn-SOD基因在肝脏中的相对表达量先升高后下降,在半窒息时显著降低;鳃中Mn-SOD在浮头时的表达量显著降低后趋于平稳。鲢对低氧胁迫产生氧化应激,但其可以通过自身的抗氧化系统进行调节,而当溶解氧过低时机体出现损伤,甚至死亡。     

卵形鲳鲹碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的分布及其低温保存

测定了卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）在不同器官和肌肉中的活性;将样品分别置于4℃、-20℃和-80℃下保存3 d、7 d、15 d和30 d,研究不同保存温度和保存时间对样品中AKP和ACP酶活性的影响。结果表明,在卵形鲳鲹胃中未检测到AKP活性,其他器官中均检测到AKP活性,AKP活性大小顺序依次为后肠〉幽门盲囊〉肾〉中肠〉肝〉前肠〉心〉肌肉;ACP在卵形鲳鲹体内分布较广,所测器官中均有ACP活性,其活性大小顺序为肝〉肌肉〉后肠〉中肠〉幽门盲囊〉肾〉心〉前肠〉胃。低温保存试验结果表明,AKP和ACP在4℃和-20℃下保存,时间越长,活力越低;在-80℃下保存,AKP和ACP活力在30 d内基本稳定,只有幽门盲囊的AKP和ACP在长时间保存后活力明显下降。     

长吻鮠碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成

长吻鮠碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成陈定福，唐云明（西南师范大学生物系，重庆６３０７１５）关键词长吻．肝脏，碱性磷酸酶，分子量，氨基酸组成ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＷＥＩＧＨＴＡＮＤＡＭＩＮＯＡＣＩＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＯＦＡＬＫＡＬＩＮＥＰＨＯＳＰＨＡＴ...     

Purification and characterization of alkaline phosphatase from the gut of sea cucumber Stichopus japonicus

An alkaline phosphatase was purified from the gut of sea cucumber Stichopus japonicus by n-butyl alcohol extract, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography with diethylaminoethyl cellulose, gel filtration chromatography with Sephacryl S-200 and preparative electrophoresis with polyacrylamide gel electrophoresis. The native enzyme was estimated to be 166 ± 9 kDa and produced a single predominant band corresponding to active enzyme on nondenaturing electrophoresis, but showed 2 bands of 97 and 35 kDa on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, suggesting that the native enzyme is composed of two dissimilar subunits. The enzyme displayed maximum activity at pH 11 and 40 °C, showing narrow pH stability (pH 10–12) and thermal instability at temperature higher than 30 °C. The activity of the purified alkaline phosphatase was enhanced by Mg²⁺, whereas inhibited by Zn²⁺, Ca²⁺ and EDTA at 1 and 10 mM, suggesting its activity is in a magnesium ion-dependent manner. The product-analog WO₄ ^2? and product HPO₄ ^2? showed strong inhibitory effects on the enzyme activity. Using p-nitrophenyl phosphate as substrate, the V _max and K _m values were 24.45 μmol/L min and 5.76 mM, respectively.     

性早熟中华绒螯蟹肝胰腺与性腺的酸性和碱性磷酸酶活性

采用磷酸苯二钠法在520nm波长测定了未成熟、早熟和正常成熟中华绒螯蟹肝胰腺与性腺中的酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）。结果表明：（1）各组蟹肝胰腺ACP和ALP活性都显著高于性腺；（2）早熟蟹肝胰腺中ACP活性都显著高于未成熟蟹而低于正常成熟蟹，在各发育阶段没有性别差异，但是，早熟雌蟹和正常成熟雌蟹卵巢中ACP活性都较早熟雄蟹和正常雄蟹精巢低，早熟与正常成熟个体没有差异；（3）早熟雌蟹肝胰腺ALP活性显著高于未成熟和正常成熟雌蟹，而与三组雄蟹处于同一水平，但是，早熟和正常成熟雌雄蟹的性腺中ALP活性没有显著差异。由此得出结论：（1）性腺发育所需营养物质的动员或合成主要与肝胰腺ACP有关；（2）性早熟的发生与肝胰腺中ACP和ALP活性的显著升高有关。     

大黄鱼碱性磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系经LPS处理后6 h LcALP表达量降低,12 h显著下调,而poly I:C处理后表达水平持续上升,24 h显著上调至峰值。研究表明,LcALP在大黄鱼胚胎发育调控以及机体免疫防御中发挥重要作用。     

中华倒刺鲃仔稚鱼期消化酶及碱性磷酸酶活性变化的研究

本试验选取了中华倒刺鲃从初孵仔鱼到30日龄稚鱼，分析测定了中华倒刺鲃的特定生长率、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和碱性磷酸酶的活性。结果表明：在整个试验期间，中华倒刺鲃的SGR为26.43%。在初孵仔鱼体内就能检测到胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和碱性磷酸酶的活性。胰蛋白酶在内源营养阶段具有较高的活性，在4日龄开口时其比活力降到一较低值，随后呈现增加的趋势，在18日龄达到最低值后又缓慢增加。淀粉酶在试验期间表现出较高的活性，比活力一直呈增加的趋势。脂肪酶在18日龄前其比活力一直增加，并且在7-18日龄表现出较高的比活力水平，18日龄后快速下降。碱性磷酸酶活性则呈现出一直增加的趋势。     

泥鳅仔稚鱼发育期间消化酶及碱性磷酸酶比活力的变化

研究了泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)从孵化至30 DAH(日龄,Days after hatching)几种消化酶及碱性磷酸酶比活力的变化情况。胃蛋白酶直至30 DAH仍未检出活性。而胰蛋白酶表现出较高的比活力,其比活力在初次摄食之后显著上升,6 DAH达到最大值之后开始显著降低(P<0.05)。脂肪酶与淀粉酶的变化模式相似,在内源性营养向外源性营养转变及仔鱼向稚鱼转变这两个时间段出现两个高峰值。碱性磷酸酶比活力在2-6 DAH显著上升(P<0.05),之后开始下降并趋于平稳。研究表明,泥鳅在仔稚鱼阶段只具有结构性的胃而缺乏分泌细胞的分化。2-6 DAH是泥鳅仔鱼肠道功能迅速发育的阶段,也是向成鱼消化模式转变的一个重要过程。脂肪酶和淀粉酶比活力的持续性表明了泥鳅仔鱼对糖类和脂肪有较好的利用能力。     

汞暴露对草鱼器官组织中碱性磷酸酶活性的影响

测定暴露于不同汞离子质量浓度(0 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L)下草鱼(Ctenopharyngodon idella)血清、鳃、肝胰脏、脾、肾脏和肌肉等组织器官中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性。研究目的在于评价汞离子对草鱼生理代谢的影响。暴露周期为21 d。结果显示,与对照组相比,血清AKP活性在0.05mg/L、0.10 mg/L和0.15 mg/L汞暴露组无显著性变化(P>0.05),而在0.20 mg/L、0.25 mg/L组显著下降(P<0.01);鳃AKP活性在0.10 mg/L和0.15 mg/L汞暴露组显著上升(P<0.05或P<0.01),而0.05 mg/L、0.20 mg/L和0.25mg/L组无显著变化(P>0.05);肝胰脏和脾脏AKP活性在所有实验组均显著下降(P<0.01);肾脏AKP活性在0.05mg/L组无显著变化,其他实验组均显著升高(P<0.01);肌肉AKP活性在所有实验组均无显著性变化(P>0.05)。本研究说明草鱼暴露于不同汞离子浓度下,具有不同生理功能的器官组织的AKP活性变化存在较大差异     

海水中几种金属离子对中国对虾幼体_省略_内碱性磷酸酶和ATPase的影响

向经过螯合剂Cephlex 100处理的海水中添加金属离子，进行培养中国对虾糖虾幼体和仔虾幼体，观察篱子对变态发育及其体内碱性磷酸酶和ATPase活性的影响。结果显示当海水中Cu^2 ,Co^2 ,Mn^2 浓度分别为40、40、20μg.L^-1时明显激活糠虾幼体体内碱性磷酸酶的活性，但大于此浓度时则使该酶活性降低；Cu^2 低浓度时能够提高仔虾体内碱性磷酸酶和ATPase的活性，浓度在40μg.L^-1时碱性磷酸酶的活性表达最高，在40－80μg.L^-1浓度范围内ATPase活性明显高于对照组，较高浓度则抑制两种酶的活性。Co^2 在200 μg.L^-1时期显提高两种酶的活性，而Ni^2 只使两种酶活性降低。鉴于碱性磷酸酶和ATPase与生长发育直接和相关，篱子对虾幼体生长的影响与对两种酶活性的影响基本一致，因此体内这两种酶活性的高低可作为判别环境因素是否适合对虾幼本生存的指标。