牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein ASepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%~50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1∶32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1∶1 600。运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。     

牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析结合Sephacryl S-300凝胶过滤层析及DEAE Sepharose离子层析法,对牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig)进行了分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blotting技术对纯化蛋白的部分特性进行了分析。结果表明,30%、50%饱和硫酸铵分步盐析可以去除牙鲆黏液中除Ig外的很多杂蛋白,得到粗提黏液Ig;再经Sephacryl S-300纯化,Ig纯度较高,其中含有72和26 ku的条带;DEAE Sepharose层析法可进一步纯化Sephacryl S-300柱层析的产物,所提取黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72和26 ku两个条带,初步认为是牙鲆黏液Ig的重链和轻链。Western-blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig单克隆抗体可与黏液Ig重链72 ku条带发生发应。     

大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼（Pseudosciaena crocea）血清中的免疫球蛋白（IgM）进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测.结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右.用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1：40 960的兔抗鱼IgM血清.本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM.本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础.[中国水产科学,2006,13（3）：475-479]     

欧洲鳗皮肤黏膜免疫球蛋白纯化及其结构组成分析

应用亲和层析技术提纯欧洲鳗(Anguilla anguilla)黏膜免疫球蛋白(Ig),并在结构和抗原性上进行分析.柱层析结果表明,欧洲鳗黏膜Ig经亲和层析分离后出现1个锐形的蛋白峰,蛋白主要分布于收集物的第2-6管,蛋白峰和抗原活性峰重叠.凝胶电泳结果显示,在变性还原条件下,欧洲鳗黏膜Ig重、轻链分子量分别为68 kD和26 kD,还有1条分子量约为18 kD的蛋白带;在非变性非还原条件下,黏膜Ig只有1条蛋白带,分子量约为350 kD,略旱扩散拖带现象,这一结果提示自然条件下欧洲鳗黏膜Ig可能以二聚体形式存在;在变性非还原条件下,黏膜Ig有3条蛋白带,分子量约为350 kD、138 kD和135 kD,表明欧洲鳗黏膜Ig在SDS作用下可发生不同程度的解聚.Western-blotting试验证实,兔抗血清能识别欧洲鳗黏膜Ig的二聚体、解聚体、重链和81 kD、84 kD处的蛋白带,显示出黏膜Ig的抗原特异性.欧洲鳗黏膜Ig与血清Ig在结构和抗原性上的差异.为进一步探讨欧洲鳗是否存在相对独立的黏膜免疫系统奠定了基础.     

鳜皮肤黏液IgM样蛋白的纯化

对经嗜水气单胞菌全菌疫苗浸泡免疫后的鳜皮肤黏液中的免疫球蛋白采用盐析法、重组蛋白A(HiTrap rProteinA Sepharose)亲和层析法及鼠抗鳜血清IgM单克隆抗体偶联的Sepharose 4B亲和层析法分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较。结果表明:50%硫酸铵溶液可以沉淀黏液中大部分蛋白,条带仍较多,约十几条,其中含有72 ku和29 ku的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;Sepharose 4B亲和层析法所提取鳜黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72 ku和29 ku 2个条带(初步认为鳜黏液Ig的重链和轻链),与鳜血清IgM的重、轻链分子量相同;rProteinA亲和层析法所提蛋白除具有上述重链(72 ku)和轻链(29 ku)外,还含有43 ku的蛋白带(可能为鳜黏液Ig另外一种形式的重链)。Western-blot显示,兔抗鳜Ig多克隆抗体可与72 ku及43 ku条带发生发应。两种亲和法所提蛋白纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯鳜黏液Ig的有效方法。     

欧洲鳗鲡血清免疫球蛋白纯化及其结构分析

应用亲和层析技术提纯欧洲鳗鲡免疫球蛋白（Ig），并对欧鳗Ig的结构和抗原性进行分析。层析结果表明：Ig蛋白呈现一个锐形曲线，蛋白峰与抗原活性峰高度重叠。SDSPAGE分析表明：欧鳗Ig重链分子量为68 kD，轻链有3条，分子量分别为21 kD、23 kD和26 kD。凝胶电泳结果显示：在非变性非还原条件下，欧鳗Ig有790 kD和350 kD 2条蛋白带，在变性非还原条件下有790 kD、593 kD和350 kD 3条蛋白带。Western-blotting试验证实：兔抗欧鳗Ig能识别欧鳗Ig的多种不同聚合体和Ig的重链，但不能识别Ig的轻链。结论：欧鳗Ig在自然条件下可能以四聚体和二聚体的形式存在，这与其它硬骨鱼的Ig形式有差异。欧鳗Ig链间二硫键不健全,在SDS作用下可解聚产生多种不同分子量的聚合体，首次揭示欧鳗Ig的轻链有3种异型。     

温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响

在9℃、15℃、21℃和26℃4种不同水温下,用淋巴囊肿病毒(LCDV)灭活疫苗腹腔注射牙鲆,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)研究了其皮肤黏液中特异性抗体水平的变化,以分析温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响.ELISA结果表明,9℃和15℃水温下牙鲆黏液OD值分别在注射LCDV后第9周和第7周达到峰值(9℃:OD=0.179; 15℃:OD=0.233); 21℃水温下OD值上升最快,5周达到峰值(0.316); 26℃水温下OD值较21℃无显著差异,也于5周达到峰值(0.295).采用硫酸铵分步盐析等技术粗提不同温度下OD值最高时的牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig),SDS-PAGE检测发现,各温度组黏液蛋白中均含有72 kD和26 kD蛋白条带.Western blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体只与黏液蛋白中72 kD条带发生反应,确定为牙鲆皮肤黏液Ig重链.综上结果表明,牙鲆在最适生活温度(21℃)下,抗体应答强度最大.牙鲆粗提黏液蛋白中Ig的初步确定,为探索牙鲆黏液免疫机制提供了材料.     

欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析法结合柱层析提取，纯化欧洲鳗血清免疫球蛋白（Ｉg) ,实验证实欧洲鳗Ｉg主要分布在硫酸铵饱和度３０％－５０％的区间内，Ｓephacry1-S200进一步提纯的Ｉg主要存在于第一个蛋白峰，而Ｓepharose-4B柱层析提纯的Ｉg则存在于第二个蛋白峰，ＤＥＡE-52脑子交换柱层析可进一步纯化Ｓepharose-4B柱层析的产物，ＥＬＩＳＡ和Western-blot分别证实上述提取物具有抗体的免疫学活性，ＳＤＳ－ＰＡＥＧ分析纯化的Ｉg，显示了洲鳗Ｉg重链约为６８kD，轻链约为２６kD.     

小体鲟卵黄雌性蛋白分离纯化及抗血清的研制

采用凝胶柱层析法,对小体鲟(Acipenser ruthenusLinnaeus)卵黄蛋白粗提液进行分离纯化。小体鲟卵黄蛋白粗提液的质量浓度为25.04 mg/mL,经Sephadex G-200层析后出现3个蛋白峰。用聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹(Western-blotting)和免疫扩散等方法研究表明,小体鲟卵黄蛋白由分子量分别为132.1 kD、97.4 kD、85.9 kD、67.0 kD、59.2 kD、47.6 kD、30 kD、14.3 kD和12.8 kD的9个亚基组成;层析后峰B蛋白为卵黄雌性特异蛋白(yolk female specific protein,YFSP),是一种糖脂磷蛋白,具有雌性特异性和组织特异性,抗体具有种属特异性。Western-blotting结果表明,卵黄雌性特异蛋白(YFSP)与血清雌性蛋白(FSSP)免疫印迹图谱上都显示分子量为97.4 kD和30 kD的2条杂交带,可见两种蛋白在免疫原性上具有相似性,可以用卵黄雌性蛋白抗血清代替卵黄蛋白原抗血清对卵黄蛋白原进行检测     

锯缘青蟹凝集素的提取及单克隆抗体制备

凝集素是无脊椎动物非特异性免疫系统的重要组成成份，可凝集外来病原菌、进行非己识别、调理和介导血细胞吞噬。开展了锯缘青蟹血清凝集素的提取、单克隆抗体制备及凝集素定位研究，以N-乙酰基葡萄糖胺（N-Acetyl-D-glucosamine，GlcNac）为配基制备了Sepharose 4B亲和层析柱，可选择性结合青蟹血清凝集素；青蟹血清通过亲和层析柱后，以0.45 mol/L NaCl洗脱，得到有较高凝集活性的单一洗脱峰，该洗脱峰凝集素比活为血清凝集活性的32.6倍，SDSPAGE显示存在87 ku和79 ku主要蛋白成分；以纯化青蟹凝集素免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、单抗筛选获得BF82等7株可稳定分泌抗凝集素单抗的小鼠杂交瘤细胞株，单抗腹水的ELISA效价为1∶10⁴～1∶10⁵；单抗可特异性抑制青蟹凝集素的血凝，血凝抑制效价为1∶32～1∶64，亚型鉴定表明7株单抗均为IgG1型，免疫印迹表明单抗可特异性结合87 ku、79 ku蛋白；采用凝集素单抗间接免疫荧光法进行了青蟹血淋巴细胞染色，结果显示凝集素主要分布于颗粒细胞的细胞质颗粒和透明细胞的细胞膜上。     

Antibody production in Japanese eels, Anguilla japonica Temminck & Schlegel

Adult Japanese eels, Anguilla japonica Temminck & Schlegel, (200–250 g, 45–55 cm) were immunized by intramuscular injection with goat IgG. After 5 weeks, eel immunoglobulin (Ig) was purified using affinity chromatography. The purified eel Ig was used to immunize rabbits to produce anti-eel Ig antibody. The highest antibody ELISA value in eels was reached 3 weeks after initial immunization with goat IgG, and then gradually decreased. The antibody could still be detected at 140 days post-immunization. The optimal temperature for antibody production was 30°C. Freund's complete adjuvant and secondary immunization both increased antibody production in eels.     

Summer habitat affinities of estuarine fish in US mid-Atlantic coastal systems

Fisheries management strategies based on habitat protection require definitive assessment of fish habitat affinities, but most habitat association information is based on disparate data from multiple sampling strategies. Habitat affinities were quantitatively defined using consistently collected data with a 16-m high-rise otter trawl at 314 Virginian Province (US) sites from 1990 to 1993. Catch rates and field-recorded salinity, depth, sea bed type, and geography (coastal system) associated with each trawl were analysed. Habitat affinity was quantified by comparing the concentration of fish in a particular habitat with the prevalence of that habitat. Fishes exhibited a specific habitat affinity even though they occurred across a range of environmental gradients. Fish were most associated with salinity (14 of 19 species/life-stage groups had a significant affinity for at least one salinity zone). Three-quarters of the flatfish displayed an affinity for a selected sea bed type; the same percentage of sciaenids had an affinity for a particular salinity zone.     

应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌——鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌-鳗弧菌（Vibrio anguillarum)W-1为抗原，制备兔抗血清；利用异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白（FITC-IgG）为荧光标记二抗，并以罗丹明标记的牛血清白蛋白为背景染色，建立检测鳗弧菌的间接荧光抗体快速检测技术。应用该技术对人工感染后的花鲈组织（肌肉、鳃、肠、肾）样品和养殖水体样品进行了鳗弧菌检测，结果显示间接荧光抗体技术不仅可以用于诊断发病的感染花鲈，也可用于检测带菌状态或未发病的感染花鲈。     

Estrogen binding sites in the ovary of the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.)§

The binding characteristics of the European sea bass estrogen receptor (ER) were determined in ovarian cytosolic and nuclear extracts. Results were consistent with the presence of a single class of high affinity and low capacity ER, the first to be characterized in teleost ovary. This will contribute to our understanding of changes in ER affinity and abundance during sex differentiation in this economically important species.     

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。     

LH和hCG对山羊卵母细胞体外成熟的影响

试验研究促黄体素(LH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)对山羊卵母细胞体外成熟的影响。在摘取卵巢获得未成熟卵母细胞后,分别置于含不同浓度LH、hCG的成熟液和LH+hCG以不同浓度组合的成熟液中,进行体外成熟培养。结果表明,LH对山羊卵母细胞的体外成熟有一定的促进作用。     

秦皇岛地区波尔山羊及其杂交后代繁殖性能的研究

对秦皇岛市波尔山羊繁育改良中心的波尔山羊繁殖性能进行观察和研究。结果表明:(1)波尔山羊适宜的初配年龄:公羊应为15～18月龄;母羊应为10～12月龄。(2)波尔母羊一年四季均可发情,但多集中于秋季和初冬季节,尤其是秋季性活动旺盛。(3)波尔母羊平均发情周期为20.75d,范围在18～23d。(4)母羊的发情持续期为30～36h。(5)产后出现第一次发情的时间平均为102d左右。(6)头胎受胎率为100%,二胎受胎率为85.71%。(7)纯种母羊的妊娠期平均为151.37d,杂交后代妊娠期平均为150.22d。(8)不同胎次母羊的产羔率:纯种羊为162.16%,杂交后代羊为153.66%。不同季节母羊的产羔率:纯种羊的为164.10%,杂交后代羊的为158.54%。(9)产羔成活率:纯种羊为93.55%,杂交后代羊为98.46%。     

酉州乌羊生长曲线拟合分析研究

对酉州乌羊体重随月龄增长应用Logistic、Gompertz、Richards模型进行生长曲线拟合分析,建立公、母羊的拟合曲线方程及求出拐点体重、拐点月龄。结果表明:三种模型均能很好地拟合公、母羊生长规律,Logistic、Gompertz、Richards模型拟合公羊的拟合度(R2)分别为0.987、0.995、0.987,母羊拟合度(R2)0.968、0.9810.968,三种模型相互比较,Gompertz模型拟合效果最好。     

Influences of El Niño on assemblages of mesopelagic fish larvae along the Pacific coast of Baja California Sur

Seasonal assemblages of mesopelagic fish larvae and changes related with environmental factors (plankton biomass, sea surface temperature anomaly, upwelling, and the multivariate El Niño index) were investigated. From 1982 to 1987, 16 oceanographic cruises were carried out along the Pacific coast of Baja California Sur, Mexico. Larvae of 42 mesopelagic fish taxa were collected. Larval abundance was highly variable during the studied period, but summer months coincided with higher abundance (>200 larvae under 10 m²). Larval assemblages were dominated by three of the most common species of tropical (Vinciguerria lucetia, Diogenichthys laternatus) and subtropical affinity (Triphoturus mexicanus). A group of species of tropical affinity (Diplophos proximus, Diaphus pacificus, Benthosema panamense) was useful for distinguishing the 1982–84 El Niño event, and an assemblage of larvae of temperate affinity (Symbolophorus californiensis, Melamphaes lugubris, Bathylagus ochotensis, Leuroglossus stilbius, Protomyctophum crockeri) characterized ‘normal’ years (mid‐1984 to mid‐1987).     

中东太平洋公海金枪鱼延绳钓误捕海龟的观察和分析

根据2006年2－11月科学观察员对热带东太平洋公海海域(05°N～10°S,134° W~173°W)金枪鱼延绳钓渔业的调查，期间共投钩223次(天)，误捕到绿海龟、蠵龟、丽龟、玳瑁和棱皮龟5种共22尾，死亡海龟13尾。从海龟误捕率看，平均每次尾数为0.098 65。平均每千钩尾数0.037 40。从海龟的钩获部位看，喙(嘴)上钩占41.0%，躯干部位上钩占13.6%，喉部上钩占13.6%，前肢上钩占18.2%，主绳缠绕被捕获占13.6%。海龟的误捕区域位于04°S以北海域，几乎可全年捕获。此外分析了不同钩位误捕海龟的数量，探讨了影响误捕率和死亡率的因素，提出保护对策。