萼花臂尾轮虫非混交雌体SOX基因的克隆与分析

选用根据SOX基因蛋白序列设计的1对兼并引物,采用PCR技术扩增萼花壁尾轮虫(Brachionus calyciflorus)非混交雌体基因组DNA。结果显示:实验得到1个约220 bp的片段。经过克隆和测序分析,共获得2个有差异的DNA片段,其中一个DNA片段证明为萼花臂尾轮虫SOX2蛋白编码序列,与人和秀丽隐杆线虫(Cae-norhabditis elegans)DNA序列碱基组成相似性分别为68.98%和75.93%,其编码的氨基酸序列与人、秀丽隐杆线虫SOX2蛋白相似性分别为为84.72%和81.94%。另一个DNA片段长209 bp,用BLAST程序在GenBank数据库中搜索,没有找到相似性序列,用该序列推导氨基酸序列,发现两个终止密码子,推测该片段是受到自然选择作用失去功能的SOX基因。同时对多个物种的SOX2基因保守序列进行比对,发现萼花臂尾轮虫SOX2基因是一种古老的基因形式,具有高度的保守性。     

斑节对虾Sox基因HMG盒的PCR扩增及SSCP分析

SRY基因是人类及哺乳动物睾丸决定因子的最佳候选基因，HMG盒是SRY基因编码蛋白质的唯一功能区，在性别决定中极其重要且高度保守，许多进化程度上明显不同的物种中都能检测出SRY基因的HMG盒，即Sox基因。斑节对虾是一种重要经济虾类，其性别决定机制研究薄弱，至今未找到性染色体。本研究根据人的SRY基因的HMG盒保守区的核苷酸序列，设计了1对兼并引物，通过PCR扩增出斑节对虾的Sox基因，并对扩增产物进行SSCP分析。结果表明，斑节对虾雌雄个体均存在Sox基因，从雌雄个体中均扩增出约350bp和220bp两条基因片段，推测其中350bp片段含内含子，SSCP结果显示斑节对虾内存在Sox基因家族的不同成员，且雌雄存在差异最后我们讨论了对虾性别决定可能的机制。     

4种鳕鱼线粒体16SrRNA、COI和Cytb基因片段序列的比较研究

对狭鳕(Theragra chalcogramma)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、蓝鳕(Micromesistius poutassou)和远东宽突鳕(Eleginus gracilis)4种不同属鳕鱼的线粒体16S rRNA、Cytochrome oxidase subunit I(COI)和细胞色素b(Cyt b)基因片段序列进行了测定,分析比较了不同鳕鱼种间的序列差异.通过PCR扩增和序列测定,得到4种鳕鱼线粒体3个基因片段的总长度分别为539 bp(16S rRNA)、601 bp(COI)和385 bp(Cyt b),其基因片段的A+T含量都较高.4种鳕鱼种内个体间序列变异较小,3个基因片段的核苷酸替代速率依次为Cyt b＞ COI ＞16S rRNA.Cyt b 基因片段序列的分析结果显示太平洋鳕和狭鳕间分歧时间约为219万年,发生于中新世(Mio-cene);宽突鳕与蓝鳕间分歧时间约为653万年,发生在上新世(Pliocene).根据遗传距离构建的NJ系统树表明,狭鳕与太平洋鳕的亲缘关系较近,与蓝鳕的亲缘关系较远.     

大黄鱼、鮸鱼及美国红鱼线粒体DNA的Cyt b基因序列比较

利用PCR技术对大黄鱼Pseudosciaena crocea、鮸鱼Scioenops ocellatus和美国红鱼Miichthys miiuy线粒体DNA的细胞色素b（Cytb）基因片段进行了扩增，PCR产物直接测序，分别获得大黄鱼和美国红鱼1140bp的序列，鮸鱼1125bp的序列。通过对3种鱼的cnb序列的比对分析，得出3种鱼序列的相似性为91．49％；分析了3种鱼序列的碱基组成及碱基变异情况，发现3种鱼的序列差异明显，碱基替换较多，可以将cytb基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记；计算了3种鱼序列的遗传距离并构建了系统树，结果显示，鮸鱼与美国红鱼的遗传距离较近。     

日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼细胞色素b基因序列的比较分析

利用PCR技术对日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼线粒体DNA的细胞色素b基因片段进行了扩增，PCR产物直接测序，分别获得日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼1137bp的序列。通过对两种鱼的Cyth序列的比对分析，得出两种鱼序列的相似性为99．82％；分析了两种鱼序列的碱基组成及碱基变异情况，发现两种鱼的序列差异明显，碱基替换较多，而且有2个位点可以作为区分两种鱼的分子标记。因此，可以将Cyth基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记。     

兰州鲇生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

利用长片段PCR及T-A克隆技术,从兰州鲇(Silurus lanzhouensis)基因组DNA中首次克隆兰州鲇GH基因全序列并提交至Genbank获得登录号KM215221,同时,使用DNAstar等生物信息学软件进行序列分析研究。兰州鲇GH基因全长2 067 bp,由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)为603 bp。5个外显子大小分别为10、140、117、132和204 bp;4个内含子大小分别为229、103、565和103 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。编码区编码1条由200个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。5个科8种鲶形目鱼类生长激素基因编码区序列同源性比较表明,它们之间GH基因编码区序列有较高的同源性,平均达到了92.4%,其中,兰州鲇和南方大口鲇之间的同源性最高,为99.5%,兰州鲇和革胡子鲇之间的同源性最低,为90.0%,并构建了系统发育进化树。同时也表明,GH基因编码区序列具有较高的保守性,系统发育研究中具有较高的参考价值。     

克氏原螯虾白斑病毒株(WSSV-Cc)基因组的一个印迹

从自然感染、濒死的克氏原螯虾中分离出的白斑病毒株(Cambarus clarkii whispovirus,WSSV-Cc或Cc株)是一株基因组较小的新毒株。为寻找白斑病毒进化过程在基因组中留下的印迹,进行了显微和超微观察、基因组架构与系统发育分析及相关基因扩增等研究。选择Cc株74L、86L、87R、88R、92R和95R的6个基因,与8个白斑病毒株的同源基因所编码蛋白序列构建进化树,结果可分为克氏原螯虾病毒(Cc株、CN02株、Pc株)和海水对虾病毒(CN株、CN01株、CN03株、CN04株、TW株和KR株) 2支。再对不同毒株的同源蛋白进行多重序列比对,显示Cc-87R是与海水对虾病毒株同源蛋白差异显著、缺失跨膜区(TMD)及其相邻287 aa序列、但仍有完整PI3K_rbd结构域的病毒膜蛋白。进一步设计和使用87R-F/87R-R和238-F/87R-R两对引物,分别以淡水小龙虾病毒Cc株和海水对虾病毒CN株的基因组为模板进行核酸扩增,结果从Cc株模板中扩增到大小为709 bp,含Cc-87R全部序列的核酸片段;而从CN株的模板中却扩增到大小分别为1 600和4 810 bp,仅含Cc-87R部分序列的核酸片段,为Cc-87R是Cc株基因组中一个序列结构独特的印迹提供了实验证据。这一发现将有助于克氏原螯虾白斑病毒病原的检测及其流行趋势预警。     

三疣梭子蟹Sox基因HMG盒的克隆分析

利用能扩增人类SRY基因HMG盒的一对简并引物,分别对三疣梭子蟹雌雄个体基因组DNA进行扩增,均得到216 bp和约400 bp的两条带,不存在性别差异,通过PCR-SSCP分析,未发现雌蟹或雄蟹所特有的Sox基因。对216 bp的带进行克隆测序得到6个Sox基因,分别命名为PTSox21、PTSox12、PTSox11a、PTSox11b、PTSox11c和PTSox4。其中,PTSox21、PTSox12和PTSox4氨基酸序列与人类Sox21、Sox12和Sox4基因的同源性分别为90%、66%和63%,PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c氨基酸序列均与人类Sox11基因有63%的同源性。此外,PTSox11a和PTSox11b的氨基酸序列之间的同源性达到了98.6%,只在第44位氨基酸残基不同。与其他物种Sox基因氨基酸序列的同源性比较发现,PTSox21与饰纹姬蛙Sox2a有92%的同源性,而PTSox12、PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c均与意大利蜜蜂的Sox1有73%的同源性,PTSox4与意大利蜜蜂的Sox1有72%的同源性。     

拟腹吸鳅属鱼类线粒体基因组特征与系统发育分析

为了解拟腹吸鳅属(Pseudogastromyzon)鱼类的系统发育特征,对已获得的11种该属鱼类进行线粒体基因组的测序与分析,结果表明,其线粒体基因组的长度在16 560～16 574 bp之间,且基因组成和排列模式与大多数脊椎动物线粒体基因组基本一致;各线粒体基因组序列中A+T的含量均超过50%,并存在反G偏倚现象。通过对11种拟腹吸鳅属鱼类线粒体基因组13个蛋白质编码基因与控制区序列的比较发现：在COⅠ基因中有一段6 bp的碱基插入和缺失;D-loop基因的进化速率介于蛋白质编码基因之间,ND4、ND5、Cyt b和D-loop等基因适合作为本属鱼类种间系统发育研究的分子标记。基于COⅠ基因序列的11种拟腹吸鳅属鱼类种间遗传距离以及基于线粒体基因组序列构建的11个种系统发育树研究表明,九龙江拟腹吸鳅(P.fasciatus jiulongjiangensis)与梅花山拟腹吸鳅(P.meihuashanensis)应为拟腹吸鳅(P.fasciatus fasciatus)的同物异名。9个有效种可以分为两大类：颏部吸附器为品字型的3种属于品唇鳅亚属(Labigastromyzon),...     

2种东风螺线粒体基因序列多态性研究

对来自粤东和粤西的方斑东风螺(Babylonia areolata(Link))和台湾东风螺(Babylonia formosae(Sowerby))的线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的序列进行分析,并对其遗传变异进行了比较研究。得到的序列总长度分别为506 bp(16S rRNA)和640 bp(COⅠ)。2种东风螺序列的碱基组成均显示较高的A T比例(16S rRNA基因63.5%,COⅠ基因62.4%)。对位排序比较表明,16S rRNA基因片段变异较小,台湾东风螺和方斑东风螺各存在1个碱基变异位点;方斑东风螺COⅠ片段有12个碱基存在变异,包括3个简约信息位点和9个单一多态位点;台湾东风螺COⅠ片段有17个碱基存在变异,包括4个简约信息位点和13个单一多态位点。数据分析结果表明:2种东风螺线粒体的COⅠ基因比16SrRNA基因具有更高的多态性,COⅠ基因序列更适用于东风螺种群的遗传多样性分析。方斑东风螺的平均核苷酸差异和核苷酸多样度分别为2.68和0.004 2,台湾东风螺则分别为5.62和0.007 8,说明台湾东风螺的遗传多样性高于方斑东风螺。无论是方斑东风螺和台湾东风螺,粤东群体的平均核苷酸差异和核苷酸多样度都大于粤西群体,说明粤东群体的遗传多样性高于粤西群体。     

皮氏蛾螺和水泡蛾螺线粒体基因组及核糖体ITS2的比较研究

利用PCR技术分别扩增皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体全基因组以及核糖体第二转录间隔区ITS2,对所得序列进行了分析。结果表明,皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体基因组全序列长度分别为15 255bp、15 265bp,具有相似的碱基组成和AT含量,其基因排列顺序完全一致,蛋白质编码基因长度相同,两种螺的ITS2分别为340bp和329bp,一致性达83.6%。经比对发现,皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体基因组及ITS2序列与已知的新腹足目动物相似。利用线粒体全基因组和核糖体序列构建系统发育树,两种序列的分析均显示皮氏蛾螺和水泡蛾螺亲缘关系较近。     

对虾一种杆状病毒多角体蛋白基因的PCR扩增

根据已发表的几种杆状病毒的多角体基因的序列比较与分析，设计并合成两对ＰＣＲ简并引物Ｐ—６０／Ｐ７４０和Ｐ１６４／Ｐ６４０，从纯化的对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒提取ＤＮＡ并进行ＰＣＲ扩增，Ｐ—６０／Ｐ７４０的扩增片段较为复杂，基中１条的长度为８００ｂｐ的主带与设计的ＤＮＡ片段长度相近。Ｐ１６４／Ｐ６４０经优化ＰＣＲ的反应条件后，成功地扩增出与设计相同的约４８０ｂｐＤＮＡ片段。进一步的实验表明，Ｐ—６０／Ｐ７４０扩增的分子量为８００ｂｐ的片段可被Ｐ１６４／Ｐ６４０引物对扩增，分子量与预期的相同，初步研究结果显示，Ｐ—６０／Ｐ７４０可用于杆状病毒多角体蛋白全基因的克隆，Ｐ１６４／Ｐ６４０对于对虾杆状病毒的调查和研究有实际应用价值。     

虾虎鱼科(Gobiidae)基因组微卫星DNA的分布特征

为了解虾虎鱼科(Gobiidae)鱼类基因组遗传结构特征，本研究自主开发矛尾复虾虎鱼(Synechogobius hasta)微卫星序列153条，结合从 GenBank 中筛选出的虾虎鱼科微卫星序列535条，合计686条微卫星序列，隶属于19种虾虎鱼，序列总长度为295062 bp，包含473个微卫星位点，微卫星位点累计长度为33370 bp。统计微卫星重复类型，发现在所有微卫星重复类型中以二碱基重复出现次数最多，位点数为361个，占总微卫星的76.32%，其中，重复拷贝类别最多的是 AC (340个)，占全部微卫星的71.88%，占二碱基重复微卫星的94.18%，在二碱基重复类型中没有发现 AT 和 GC 两种重复类型。三碱基重复位点数为35个，占总微卫星的7.4%，其中以 ACT 重复拷贝类别最多(12个)，占三碱基重复微卫星的34.29%。四碱基重复位点数为68个，其中以 CTAT 重复最多(31个)，占总微卫星的14.38%。五碱基重复类型中只有 TCTGG和 ATCTA 两种类型，只占全部微卫星的0.42%。六碱基重复7个，占总微卫星的1.48%，六碱基重复中各重复类型出现次数相当。在所有微卫星重复类型中没有发现单核苷酸重复类型。     

舟山海域4种鲷科鱼类线粒体Cytb基因全序列克隆分析

摘要：克隆测序了分布于舟山海域的真鲷（Pagrus pagrus）、黑鲷（Sparus macrocephalus）、黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）和二长棘鲷（Parargyrops edita）4种鲷科鱼类的线粒体Cytb基因1141bp的全序列。通过对4种鲷科鱼类Cytb基因序列的比对分析，发现了292个核苷酸变异位点，其中存在186个信息位点，序列中的转换大于颠换，碱基替换多发生于密码子第3位。遗传距离分析表明，4种鲷科鱼类的遗传差异在0．0967～0．2275之间，其中真鲷与二长棘鲷之间遗传距离最小，为0．0967，黄鳍棘鲷与二长棘鲷的遗传距离最大，为0．2275；序列变异的转换／颠换比值在2．2930～7．3587之间。以25种鲈总科鱼类构建的系统树表明鲷科鱼类与其他科的鱼类存在较远的遗传亲缘关系。     

4种河蓝蛤线粒体COI和16S rRNA基因序列的种间遗传分析

对光滑河蓝蛤Potamocorbula laevis、黑龙江河蓝蛤P.amurensis、焦河蓝蛤P.ustulata、红肉河蓝蛤P.rubromuscula4个野生种共40个个体的线粒体COI和16SrRNA基因片段进行了扩增和测序,经过筛选和剪切,得到长度为650bp和450bp的片段。序列分析显示,序列的碱基组成中G+C含量较低,16SrRNA基因种间和种内的变异较低,COI基因片段种内和种间的变异较高。以沙海螂Mya arenaria为外群,用MEGA 4.0软件中的NJ法构建了系统进化树,通过遗传距离和系统进化树可以看出,4种河蓝蛤未能达到不同种之间显著的遗传分化。     

Phylogenetic analysis and species identification of popular shrimp species in southeast China using the first internally transcribed spacer of ribosomal DNA

The ribosomal DNA internally transcribed spacer 1 (ITS1) was investigated in the search for an appropriate genetic marker that was suitable for phylogenetic study and species identification of eight major exported shrimp species in southeast China. Using the selected primers, the amplified ITS1 sequences exhibited a high degree of length polymorphisms, ranging from 448 bp in Metapenaeopsis dalei to 1491 bp in Macrobrachium nipponense . Many microsatellite loci were found at the 5' end and in the middle region of ITS1, which seemed to be associated with intragenomic sequence variation among samples of the same species. This variation might obscure the phylogenetic relationship between some shrimp populations, but the separation of five Penaeus species was well supported. In combination with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymerism methods analysis, ITS1 sequences from shrimp species belonging to different families and genera could also be easily discernable. The results suggested that ITS1 was highly variable among different shrimp groups and could be an appropriate marker for species identification and molecular systematic studies.     

三种黄鳝RAPD分析的引物筛选

试验用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对黄鳝属中产自缅甸的山黄鳝、印度尼西亚的穴黄鳝及中国的黄鳝的混合DNA进行引物筛选。40条引物有35条引物扩增出多态性片段。35条引物共获得334个扩增片段,长度为250～5417bp。     

牙鲆和大菱鲆养殖群体的分子标记和遗传变异

用１６个１０碱基随机引物对养殖牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）和大菱鲆（Ａｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）进行基因组随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）遗传分析。发现：（１）多个引物具有种的特异性扩增带。其中引物Ｓ７扩增的６９０和１１６０ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６８０ｂｐ带为牙鲆的种的特异性谱带;而引物Ｓ７扩增的６５３和８８９ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６５０、８７０、９９０及１１     

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体DNA12SrRNA序列的比较

参考果蝇和蚤状Ｚａｏ的线粒体ＤＮＡ １２Ｓ ｒＲＮＡ序列进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。两种的碱基序列长度相同，为４５７ｂｐ，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量相似，分别为１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％）和１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７８ｂｐ（３８．９５％）５０ｂｐ（１０．９４％）、７０ｂｐ（１５．３２％）。中华绒螯蟹与日本绒螯蟹间有５处碱基序列差异，在９８ｂｐ、１５１ｂｐ、３１７ｂｐ和４１７ｂｐ碱基处为碱基转移，在２９４ｂｐ碱基处为碱基颠换。     

微卫星标记在坛紫菜丝状体品系DNA指纹构建中的应用

用从条斑紫菜EST数据库中筛选合成的微卫星引物对8个坛紫菜丝状体品系进行微卫星DNA指纹扩增。5个微卫星引物共扩增出32条带，其中3对引物所扩增出的5个条带(AU192094—127、AU187410—335、AU187410—190、AU194267—203和AU194267—328)被用来构建8个坛紫菜丝状体品系的DNA指纹。在这个图谱中，每个丝状体品系都有独一的指纹模式，彼此很容易被区分开。所获得的DNA指纹图谱，可用来进行孟德尔分离研究，及为坛紫菜纯系鉴定提供分子基础。