用免疫蛋白质组学方法筛选哈氏弧菌免疫反应蛋白

用免疫蛋白质组学的研究方法鉴定了哈氏弧菌的免疫反应蛋白。将哈氏弧菌接种于TSB培养基28℃培养18h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,一向电泳采用7cmpH4～7的胶条进行等电聚焦,二向用12.5%的SDS-PAGE胶分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,获得双向电泳图谱,再结合免疫转印技术检测免疫反应的蛋白质,利用ImageMaster 2D Platinum进行配对分析得到15个非特异性的免疫反应性蛋白点,30个特异性的免疫反应性蛋白点。经过鉴定得到13种非特异性的免疫反应性蛋白质,这其中有2对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白;同时得到28种特异性的免疫反应性蛋白质,有一个蛋白点没有在数据库中查找到相对应的蛋白质,还有1对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白。将特异性免疫反应蛋白鉴定结果与非特异性比较发现有1对蛋白鉴定为同一种蛋白;另外,No.17和No.19是F0F1 ATP synthase的两个亚基。特异性免疫反应蛋白鉴定结果中有6个蛋白质是已知的其他细菌的具有免疫反应的蛋白,分别为OmpN,OmpW,OmpU,alanine dehydrogenase,Elongation factor...     

鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白双向电泳与质谱鉴定

为建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱并进行质谱分析,利用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术对嗜水气单胞菌的蛋白质组学进行鉴定研究。结果显示,嗜水气单胞菌28°C培养12 h、三氯醋酸(TCA)/丙酮沉淀法提取全菌蛋白、等电聚焦20 000 Vh的2-DE图谱匹配率达81%;采用18 cm、p H 3-10 IPG胶条进行2-DE分析获得146个蛋白点,随机选取部分蛋白点进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,共鉴定23个蛋白点包括膜脂蛋白、分子伴侣、30S核糖体蛋白S1、延伸因子、细胞色素C等,其中发现烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、精氨酸脱亚氨酶、ATP合酶α亚基、脱氧核糖核酸聚合酶亚基α、氨基甲酸激酶、腺苷酸激酶、尿苷磷酸化酶、硝基还原酶、肽酰脯氨酰异构酶共计11个代谢相关蛋白酶;基于分子功能进行蛋白分类(GO)分析,发现主要为结合(17.1%)、催化(14.3%)和转移酶(11.4%)等生物学过程。建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱与部分蛋白鉴定,有助于理解嗜水气单胞菌的蛋白质组学及其分子机制。     

柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原。本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3。对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株"。利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个点是差异表达的蛋白。胶内酶解、肽质量指纹图谱和串联质谱分析后,鉴定出其中的7个蛋白点,代表滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和一种可能的膜蛋白等3种蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子。     

中国明对虾血浆蛋白质组双向电泳技术的建立与主要高丰度蛋白点的质谱鉴定

中国明对虾的血浆脱盐处理后,通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,对不同pH范围IPG胶条、脱盐方式、上样量等进行了优化,并分别利用硝酸银和胶体考染方法进行染色,应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析,采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法对主要的高丰度蛋白点进行了质谱鉴定。结果显示,中国明对虾血浆在pH 4~7范围、18 cm的2-DE胶上得到了很好的分离,上样量为150 μg左右,采用银染可以获得较好的分析胶图谱；而上样1 000 μg左右,采用胶体考染方法能获得较好的制备胶图谱；通过MALDI-TOF/TOF MS鉴定的11个最主要的高丰度蛋白点都是血蓝蛋白。建立并优化了中国明对虾血浆蛋白质组学的双向电泳技术体系,为进一步开展对虾等甲壳动物的血浆蛋白质组学研究奠定了基础。     

鲫皮肤蛋白质组双向电泳与部分蛋白点的质谱鉴定

为了建立鱼类皮肤蛋白质组双向电泳图谱及质谱鉴定,以鲫为实验动物,采用蛋白双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术,进行鲫皮肤的蛋白质组学研究。结果表明,当上样量为800μg,采用18 cm、p H3~10 IPG胶条,等电聚焦80 000 Vh,2-DE图谱检测为214个皮肤蛋白点,匹配率达88%;对其中31个蛋白点进行MS/MS鉴定为22种蛋白,包括肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白、锌指蛋白585B、效应蛋白Rab15、卷曲螺旋结构域蛋白168、NCK1相关蛋白,肌酸激酶、烯醇化酶、丙酮酸脱氢酶、腺苷酸激酶同工酶等;进行蛋白功能聚类(GO)分析发现12种生物学过程,主要参与代谢、细胞、有机体、免疫应答、生物调节和信号等过程。本研究首次初步揭示鲫皮肤蛋白质组及分子机制,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。     

大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

通过对不同裂解液配方、等电聚焦程序和上样量等条件的对比试验,建立和优化了大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳的相关技术体系。试验结果表明,裂解液中添加Tris和TBP,聚焦时适当延长除盐时间,提高聚焦电压和功率,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,而17 cm pH 5~8 IPG胶条的最佳上样量为2.0 mg。通过相关条件优化提高了大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱的分辨率,为大黄鱼肝脏蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

溶藻弧菌外膜蛋白（Va-OMP）的免疫原性及免疫保护性

利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白（outer membrane protein of Vibrio alginolyticus, Va-OMP）、溶藻弧菌蛋白分子量58 kD外膜蛋白（Va-OMP58）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, Va）灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖（lipopolysaccharides of Vibrio alginolyticus, Va-LPS）菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较，VaOMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击，免疫保护率为62.5%～86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%～62.5%，对照组的免疫保护率仅为6.7%。用不同抗血清免疫小鼠，活菌攻击后，Va-OMP组存活率达到53.3%和66.7%，VaOMP58组次之，存活率为40%和50%，Va灭活菌组的存活率为33.3%和46.7%，对照组为13.3%。与对照组相比较，Va-OMP组差异较显著，保护效果较好。溶藻弧菌外膜蛋白和蛋白分子量58 kD外膜蛋白的保护性效果高于溶藻弧菌灭活菌苗和溶藻弧菌脂多糖的保护性效果，证明外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）具有较强的免疫原性。迟发性超敏反应试验也证明，OMP能诱发变态反应，间接证明OMP具有较强的引起细胞介导免疫反应的能力。因此实验证明，Va-OMP、Va-OMP⁵⁸是能在小鼠产生体液免疫和细胞介导免疫的保护性抗原。     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

海南地区溶藻弧菌耐药性及其质粒多样性的研究

调查了海南省的30株溶藻弧菌环境菌株对24种常见抗生素的耐药性,并对菌株携带质粒及其多样性进行了研究,所有菌株对洁霉素、乙酰螺旋霉素、万古霉素、氯洁霉素、制霉菌素5种抗生素完全耐药,对24种抗生素的耐药率为20.8%～66.7%,表明该地区溶藻弧菌具有严重的多重耐药性;30株溶藻弧菌中有22株不携带质粒,8株携带1～3个质粒,质粒为1.20～12.5kb;8株携带质粒的菌株共形成了7种类型的质粒指纹图谱。试验结果表明,该地区溶藻弧菌的耐药性与其是否携带质粒无明显关系。分离菌株的耐药性可能主要是由染色体相关基因引起的。     

坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

凡纳滨对虾弧菌病及其防治方法研究进展

近年来,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖生产中弧菌病的发病率越来越高,严重阻碍了我国海水养殖业的发展.文章介绍了凡纳滨对虾养殖过程中容易发生的几种弧菌病及其防治方法的相关研究,并对常见的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌这4种弧菌的研究进展进行了综述,以期为海水养殖中弧菌病的防治和控制...     

Characterization of Vibrio spp. Associated with Diseased Shrimp from Culture Ponds of Andhra Pradesh (India)

Abstract.— Surveys undertaken on diseases caused by Vibrio spp. in Penaeus monodon from culture ponds of coastal Andhra Pradesh recorded the occurrence of five types of diseases: tail necrosis, shell disease, red disease, loose shell syndrome (LSS), and white gut disease (WGD). Among these, LSS, WGD, and red disease caused mass mortalities in shrimp culture ponds. Six species of Vibrio—V. harveyi , V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum , V. vulnificus , and V. splendidus —are associated with the diseased shrimp. The number of Vibrio spp. associated with each disease ranged from two to five. Additionally, shrimp with red disease had concurrent infections with white spot syndrome virus. Vibrio harveyi in the case of LSS and WGD, V. parahaemolyticus for red disease, and V. alginolyticus for shell disease are the major etiologcal agents. Differences occur in the degree of virulence of different species of Vibrio and also different isolates of the same species. Vibrio harveyi isolated from LSS shrimp is the most virulent. In general, all the Vibrio isolates from LSS shrimp tend to be more virulent as compared to their counterparts from other diseased shrimp. It is apparent that the degree of virulence of various Vibrio isolates depends on its source and the pond environmental conditions. Most of the Vibrio isolates showed susceptibility to oxytetracycline, norfloxacin, and ciprofloxacin. The luminous V. harveyi exhibited resistance to many antibiotics and susceptibility to only three drugs. Considering the emergence of antimicrobial resistant strains of Vibrio , the need for using probiotics in place of antibiotics for disease control is stressed.     

对虾发光病生物防治技术的初步研究

本文探讨了应用哈维氏弧菌噬菌体对致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的特异性噬菌作用防治对虾发光病的必要性和可行性.实验表明:从对虾育苗场分离的对虾发光病致病菌哈维氏弧菌对46种抗菌药物的敏感性逐年减弱,1993年尚有28种敏感药物,其中中度以上敏感的有12种;而到了2003年敏感药物则只剩下9种,中度敏感的仅为头孢三嗪和壮观霉素2种,在养殖生产中常用的几种药物几乎都变为不敏感.在试验水体中添加该噬菌体可使哈维氏弧菌的数量减少2～3个数量级,可以相对减少对虾发光病的发生和虾苗的死亡.实验还显示试验虾苗的死亡与噬菌体的效价高低无关,而与加入的噬菌体上清液的有机质含量有关.     

天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性调查

采用K-B纸片扩散法和微量稀释法对从天津地区养殖的南美白对虾(Penaeus vannamei)中分离的弧菌进行耐药性调查,结果显示2020年在养殖季节从天津市患病的南美白对虾中共分离出弧菌33株,其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、创伤弧菌7株、霍乱弧菌3株。在天津市南美白对虾以副溶血弧菌污染最为严重,约占总数的45%左右。药敏结果显示分离的33株弧菌对2种及2种以上药物耐药的有27株,约占总数的81.8%,说明天津地区弧菌已经出现了多重耐药的现象;通过对33株弧菌对药物的MIC值测定,33株弧菌对恩诺沙星、氟甲喹和盐酸多西环素比较敏感,对磺胺类药物比较耐药。结果提示应加强对天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性监控。     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

乳酸杆菌L1对致病弧菌的抑制作用

以致病弧菌T1、T2为检测菌,采用平板抑菌圈检测法,研究乳酸杆菌L1及其代谢产物的抑菌能力。结果表明:L1发酵上清液对两种弧菌的抑制效果和发酵液对弧菌的抑菌作用相似,即对弧菌T1的抑制作用强于T2;L1 发酵液对弧菌T1、T2的抑制能力强于上清液,表明乳酸杆菌及其代谢物质对弧菌具有协同抑制作用;L1的发酵液经3倍稀释仍对弧菌T1有抑制作用;乳酸杆菌L1生长不同时期的代谢产物对弧菌的抑菌活性不同,代谢产物的抑菌能力在衰退期>稳定期>生长期;L1的发酵液经沸水浴处理15 min其抑菌活性不变,表明抑菌代谢物质具有较好的耐热性。     

Production of proteinase during experimental infection of Ostrea edulis L. larvae with Vibrio alginolyticus NCMB 1339 and the antigenic relationship between proteinases produced by marine vibrios pathogenic for fish and shellfish

Abstract. Seven marine Vibrio strains pathogenic for fish or shellfish (including strains of Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. tubiashi and V. ordalii ) were categorized into three groups on the basis of their extracellular proteinases. Antiserum raised against purified Vibrio alginolyticus NCMB 1339 proteinase neutralized the enzymes produced by all seven Vibrio strains and, on immunodiffusion, the V. alginolyticus proteinase gave a reaction of partial antigenic identity with the other Vibrio strains. In experimental infections of Ostrea edulis larvae with V. alginolyticus , the production of proteinase was demonstrated by immunofluorescence with fluorescein-labelled anti-serum. The toxicity of purified proteinase to larval O. edulis was significantly reduced by preincubation with antiserum but, when larvae were challenged with V. alginolyticus culture supernate containing a similar proteinase concentration, preincubation with antiserum had no protective effect.     

引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型

针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。     

Seasonal dynamics in a coastal Vibrio community examinedby a rapid clustering method based on 16S rDNA

ABSTRACT:   A rapid clustering scheme for Vibrio specieswas developed based on the analysis of 16S rDNA, which compriseda group-specific polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragmentlength polymorphisms (RFLP) of the PCR-amplified 16S rDNA. The group-specificPCR, using a specific primer Vib1F, clustered the Vibrio speciesinto two large groups: Vib1F⁺ group and Vib1F^– group.The PCR-RFLP, using Sca I and Bln I, further dividedthese groups into smaller groups. Finally, 46 Vibrio speciesand eight related species could be clustered into 14 groups usingthis rapid clustering method. Seasonal dynamics of the Vibrio communityin Yoshimi Bay, Hibiki-nada Sea, Japan, were examined based on therapid clustering method. In both seawater and sediments, the groupcomprised Vibrio parahaemolyticus , Vibrio alginolyticus , Vibriocampbellii , Vibrio carchariae , Vibrio harveyi and Vibrionatriegens and was predominant when the seawater temperaturewas above 20°C, whereas the group of Vibrio splendidus biotypeI and Vibrio lentus was abundant when the temperature wasaround or below 20°C.     

鲍养殖水体中致病性弧菌的调查

在18份鲍鱼养殖厂的各种水样和不同生长期的鲍样品中,共分离出17株弧菌:溶藻性弧菌11株,副溶血弧菌3株,霍乱弧菌2株,拟态弧菌1株。其中,溶藻性弧菌分布比较广,存在于各种样品;副溶血弧菌主要分布于鲍的肠道内;而非O1 O139群霍乱弧菌和拟态弧菌则分布于源头水中。鲍养殖水体中细菌总数的计数可以作为监测细菌性病害的指标之一。副溶血弧菌在鲍肠道内的高检出率提示鲍与副溶血弧菌的关系值得深入研究。