山姜对益生芽孢杆菌体外抑菌活性试验研究

为研究中草药山姜粗提液对益生芽孢杆菌体外抑菌效果,特采用试管二倍稀释法和管碟法检测不同浓度的山姜煎煮液和乙醇提取液在体外对蜡样芽孢杆菌PAS38菌株和枯草芽孢杆菌Pab04菌株的最小抑菌浓度(MIC)和抑菌直径,并以肠毒性大肠杆菌(ETEC)、4μg/mL硫酸庆大霉素作阳性对照,生理盐水作阴性对照。结果表明,山姜煎煮液和乙醇提取液对两株益生芽孢杆菌和ETEC无抑菌作用,硫酸庆大霉素对蜡样芽孢杆菌PAS38和枯草芽孢杆菌Pab04菌株MIC均为1.25μg/mL,对ETEC的最低抑菌浓度MIC为0.625μg/mL。山姜煎煮液和乙醇提取液对受试菌株抑菌直径与生理盐水相比差异不显著(P>0.05),硫酸庆大霉素与其相比差异极显著(P<0.01)。山姜粗提液对两株益生芽孢杆菌无明显抑菌作用。     

一株芽孢杆菌用作水霉病防治的研究

水霉病(Saprolegniasis)是包括草鱼等四大家鱼在内的淡水鱼最常见的真菌病,以往较为有效的防治药物为孔雀石绿,孔雀石绿禁用后渔业生产上对该病的防治遇到了极大的困难。本文分离到一株芽孢杆菌Sh1,经16S rDNA序列测定确定为解淀粉芽孢杆菌。水霉菌拮抗实验表明,Sh1菌落周围产生直径约12 mm的抑菌圈。动物安全性实验表明,腹腔注射108CFU/mL的Sh1对草鱼的生长没有任何不良影响。显微观察表明,Sh1能明显抑制水霉菌的菌丝生长。对Sh1发酵液中活性成分的理化性质进行分析,发现蛋白酶K消化、加热处理、有机溶剂抽提等都不影响其对水霉菌的抑制作用,从而推断该物质为非蛋白的耐热的可溶性化合物。这些数据表明Sh1有希望用作提取替代孔雀石绿的水霉病药物的生物药源。     

草鱼肠道芽孢杆菌的鉴定及产酶能力分析

从100 g左右的健康草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道中分离出3株疑似芽孢杆菌(Bacillus)菌株(G1、G2、G3),并通过对其进行生理生化特征、16S rDNA全序列和产酶能力的分析,筛选出1株高产酶能力的益生菌株。结果显示:G1、G2和G3菌株与枯草芽孢杆菌在16S rDNA序列相似性≥99%的水平上聚为同一分支,结合形态观察和生理生化特征,最终鉴定G1、G2和G3菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);以水解圈直径/菌落直径比值评定了G1、G2和G3菌株的产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力,其中G1菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶能力(比值分别为2.9、2.2和3.3)均高于G2、G3菌株,具有作为益生菌的潜力。     

一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽孢杆菌

对实验室暂养发病的刺参(Apostichopus japonicus)进行了微生物学分析,从所有患病个体的病灶组织分离得到了1株具绝对优势的细菌,经回接感染试验证实它对刺参具有较强的致病性.通过形态学、生理生化指标测定和16SrDNA序列分析,该菌被初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).蜡样芽孢杆菌通常被视为益生菌,广泛应用于畜禽养殖,水产养殖上也有使用.鉴于蜡样芽孢杆菌能导致刺参"腐皮综合征"的发生,建议在刺参养殖环境中应慎用该菌制剂.     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

黄鳝源嗜水气单胞菌DB01分离鉴定及药敏特性研究

从患病的黄鳝(Monopterus albus)体内分离到一株致病菌株DB01,对该菌株进行人工感染、生理生化鉴定及16S r DNA序列分析。结果显示:人工感染黄鳝出现与自然发病相同的症状,表明菌株DB01为发病黄鳝的病原菌。菌株DB01为革兰氏阴性杆菌,无芽孢和荚膜,在兔血平板上能形成明显的β-溶血。序列分析显示,菌株DB01与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源性达99%。药敏试验结果显示,菌株DB01对诺氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感,五倍子、黄柏、地榆及乌梅等中草药对菌株DB01抑菌作用强。     

一株能抑制罗非鱼源无乳链球菌的反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定

从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肠道内容物中分离筛选出具有反硝化能力并拮抗无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的芽孢杆菌好氧菌株,并对其中拮抗性最强的1株芽孢杆菌进行形态学、生理生化特性、16S rRNA基因序列鉴定,进一步研究其最适生长条件、水解淀粉和蛋白的能力,并进行菌株药物敏感试验及安全性检测。经鉴定,筛选出的菌株(命名为NY 5)为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在反硝化性能检测培养基中接种1%的NY5菌液后,对50 mg/L的亚硝酸盐氮12 h去除效率达到100%;对本实验室保存的21株不同来源的无乳链球菌均有拮抗作用,平均抑菌圈直径为(26.67±3.00)mm。NY 5在温度为25~40℃、盐度为0~40、pH为5~9的环境中生长较好。同时NY 5还具有水解酪蛋白和淀粉的功能。NY 5菌株对多数抗生素敏感,对少数检测抗生素(青霉素G、麦迪霉素、头孢唑啉等)耐药。在水体中NY5菌液浓度为2.0×10~7 CFU/mL,以及在注射200μL2.0×10~6 CFU/mL浓度NY 5菌液的条件下,体重为(6.0±1.1)g的罗非鱼均未出现死亡及其他异常现象。综合上述结果,证明筛选出的NY 5菌株为蜡样芽孢杆菌。     

罗非鱼源蜡样芽孢杆菌分离、鉴定及药敏特性研究

从福建漳州某养殖场患出血病死亡的罗非鱼肝脏、肾脏及脾脏分离到一株致病性菌株FJLF。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及16S rRNA序列分子鉴定。生理生化特征和16S rRNA基因序列分析结果显示,分离到的FJLF株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状,且从病灶中分离到与原感染菌一致菌株。腹腔注射后该菌株对罗非鱼的半致死剂量LD_(50)=2.30×10~6CFU/g。FJLF株对诺氟沙星、头孢噻肟、新霉素及卡那霉素等8种抗生素高度敏感;对环丙沙星、痢特灵、红霉素及链霉素中度敏感;对苯唑西林、青霉素、头孢拉定及阿莫西林等10种抗生素耐药。     

多抗间接ELISA方法的建立及其在海洋细菌快速检测中的应用

为了从对虾体内分离出的菌株中快速筛选出蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌,将蜡样芽孢杆菌与溶藻胶弧菌作为抗原,免疫SPF新西兰大白兔,获得免疫血清,效价均高于1:2000。将免疫兔血清作为一抗,HRP-羊抗兔血清作为二抗,建立了蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌快速检测的间接ELISA方法。此方法中,兔抗血清最佳稀释度为1:10000,菌液最佳包被浓度为106 CFU/ml;HRP-羊抗兔血清最佳稀释浓度为1:1000,可检测细菌最低浓度为104 CFU/ml。抗蜡样芽孢杆菌血清与苏云金芽孢杆菌有交叉反应,抗溶藻胶弧菌血清与其亲缘相近菌株无交叉反应,具有较强的特异性。2012年和2013年,分别从斑节对虾、中国对虾、凡纳滨对虾等9批样本中分离纯化到109株海洋细菌,利用建立的多抗间接ELISA方法对其中部分菌株进行快速检测,共检测出6株溶藻胶弧菌,未检测出蜡样芽孢杆菌。     

丹东地区常见鱼类水霉菌的分离、纯化、鉴定及拮抗菌的筛选

水霉病是一类全球分布的鱼类疾病,目前池塘养殖尚没有有效、安全的防治方法。为探究水霉病的生物防治方法,以丹东地区发生水霉病的鱼体分离出的水霉致病菌为指示菌,对从土壤、水样中分离纯化获得的62株放线菌、17株细菌进行平板对峙实验,获得2株对水霉致病菌抑制效果最好的拮抗菌,经分子生物学鉴定,分别为淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)及特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis),均对鱼类无毒力。     

Selection of probiotic bacteria for use in shrimp larviculture

Three candidate probiotics, Bacillus foraminis, Bacillus cereus biovar toyoi and Bacillus fusiformis , were isolated from hydrogen-producing fermented solution and identified using 16S rRNA sequence analysis. Bacillus foraminis and B. cereus biovar toyoi exhibited strong antagonism against Streptococcus iniae and Photobacterium damselae subsp. piscicida in in vitro co-culture for competitive exclusion assay and then were conducted in the larviculture system of Penaeus monodon reared from zoea 1 to postlarva 1. The daily addition of B. cereus biovar toyoi resulted in significantly deleterious effects on survival ( P <0.01) whereas the daily addition of B. fusiformis showed highest survival rate (88.7±0.7%) but no statistically significant difference from control (73.3±12.1%). Bacillus fusiformis was continuously applied in the larviculture system of Litopenaeus vannamei . Administration of B. fusiformis significantly increased survival ( P <0.01) in both treatments added daily (87.9±1.7%) and every other day (54.7±1.2%), respectively, at a concentration of 10⁵ CFU mL⁻¹ over control (41.2±1.3%).     

芽孢杆菌对草鱼生长和肠粘膜抗氧化功能及养殖水质的影响

本试验研究了饲料中添加芽孢杆菌对草鱼生长、肠粘膜抗氧化功能及养殖水体水质的影响。选取平均体重为（51.0±2.3）g的健康草鱼300尾,随机分成3组（对照组、处理组1和处理组2）,每组3个重复,每个重复50尾鱼。其中对照组饲喂基础日粮,处理组1和2分别饲喂含复合芽孢杆菌（105 cfu/克饲料,枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌以1:1比例混合）和枯草芽孢杆菌（105 cfu/克饲料）的基础日粮。试验期为45d。结果表明,饲料中添加芽孢杆菌对养殖水体pH和硝酸盐氮含量无显著影响,但显著降低了从第21d到试验结束期间水体中亚硝酸盐氮的含量（处理组1第35d除外）。芽孢杆菌的添加同时显著降低草鱼的死亡率（P<0.05）,并提高了草鱼的增重率和特定生长率。与对照组相比,处理组1和2草鱼的增重率分别提高了52.93%（P<0.01）和21.78%（P<0.05）,特定生长率分别提高了44.44%（P<0.01）和16.67%（P<0.05）;而且处理组1草鱼增重率和特定生长率分别比处理组2提高了25.58%（P<0.01）和23.81%（P<0.01）。肠粘膜抗氧化活性研究表明,与对照组相比,饲料中添加芽孢杆菌能提高草鱼肠粘膜超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。以上结果提示,饲料中添加芽孢杆菌可以改善养殖水质和草鱼肠粘膜抗氧化功能,并显著促进草鱼生长并降低死亡率。     

Effects of a probiotic mixture (Bacillus subtilis YB‐1 and Bacillus cereus YB‐2) on disease resistance and non‐specific immunity of sea cucumber,Apostichopus japonicus (Selenka)

The effect of a commercially available compound probiotics product containing Bacillus subtilis YB‐1 (50%) and Bacillus cereus YB‐2 (50%) fed to sea cucumbers, Apostichopus japonicus (Selenka) on challenge infections and non‐specific immune responses was assessed. Sea cucumbers (were randomly allocated into nine aquariums at a density of 30 sea cucumbers per tank and triplicate groups) were fed diets containing 0 (control), 10⁷ and 10¹⁰ cfu (g diet)^?1 of the probiotics mixture for 32 days. The growth factors and immunological parameters were measured. In addition, the effects on resistance against Vibrio alginolyticus infection were also evaluated. The results indicate that all the immunological parameters (phagocytic activity, superoxide anion production, lysozyme activity, catalase activity and phenoloxidase activity) measured and the growth rate of sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture were significantly (P < 0.05) improved than control groups at 16 and 32 days. After challenging, the cumulative mortality for the control was 100%, whereas the cumulative mortality for sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture was 47% (P < 0.05). Although the total autochthonous intestinal heterotrophic bacterial counts were not affected by dietary treatment (P > 0.05), Bacillus sp. levels were significantly elevated in sea cucumbers fed the probiotics mixture (P < 0.05). These results confirmed that administration of the probiotics mixture in the diet stimulated non‐specific immune responses and enhanced the growth performance of sea cucumbers, and was effective in controlling infections caused by V. alginolyticus.     

地衣芽孢杆菌De株对黄鳍鲷生长及其养殖池塘主要环境因子的影响

运用综合对比分析法，对黄鳍鲷（Sparuslatus）养殖中定期泼洒地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenformis）De的应用效果进行了探讨。结果表明，施用地衣芽孢杆菌De可在一定程度上优化水体环境和养殖生产性能，使养殖黄鳍鲷的成活率、体长增长率和体质量增长率分别提高18．2％、21．0％和312％；显著降低水中氨氮（NH3-N）、亚硝酸盐（NO2^-N）、活性磷酸盐（PO；一一P）质量浓度及底泥中有机碳的质量分数（P〈0．05），其中养殖前、后期的底泥有机碳质量分数分别较对照组降低49．77％和22．63％，NO2^-N、PO4^3-P质量浓度则总体较对照组降低25．82％和41．00％，NH3-N质量浓度在养殖前、中和后期较对照组降低36．33％、18．10％和14．28％；水体中弧菌数量在养殖后期较对照组降低61．76％，底泥中的总异养细菌数量在养殖中、后期较对照组提高38．61％，整个养殖期间水体及底泥中的芽孢杆菌数量分别较对照组提高15．34％和26．37％。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

酵母培养物和芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长、蛋白酶活性和免疫性能的影响

研究了饲料中添加酵母培养物(益康XP)和芽孢杆菌(Bacillus)制剂对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长、肌肉成分、蛋白酶活性和免疫功能的影响。在基础饲料(对照组)中分别添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌,饲养均重(5.57±0.21)g的凡纳滨对虾45 d。结果表明,添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌分别提高凡纳滨对虾增重率17.24%、12.29%、20.18%,降低饲料系数14.28%、9.77%、12.03%,提高蛋白质效率16.49%、10.05%、12.98%(P<0.05);添加酵母培养物和芽孢杆菌对凡纳滨对虾肌肉组成成分没有影响(P>0.05);0.075%益康XP组、0.100%益康XP组、0.200%芽孢杆菌组肝胰脏蛋白酶活性较对照组分别提高25.24%、15.22%、54.92%(P<0.05);各试验组肠蛋白酶活性与对照组相比有所提高,但均未达到显著水平(P>0.05);0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌组凡纳滨对虾血清酚氧化酶活性、溶菌酶活性和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P<0.05);攻毒实验表明,感染溶藻弧菌后,芽孢杆菌组对虾第1、3、4天的累积死亡率均显著低于对照组(P<0.05),第4天时的免疫保护率达到27.1%,而添加益康XP对累积死亡率无显著影响(P>0.05)。综上所述,饲料中添加酵母培养物益康XP和芽孢杆菌均能改善凡纳滨对虾生长性能和消化功能,芽孢杆菌能增强凡纳滨对虾对溶藻弧菌的抗感染功能。     

两种芽孢杆菌体外体内拮抗气单胞菌的试验

将蜡样芽孢杆菌Y1和巨大芽孢杆菌BM1259混合培养,结合平板活菌计数、抑菌活性测定及体内拮抗试验,研究其对水产动物气单胞菌的抑菌效果。体外拮抗试验结果表明,这两种芽孢杆菌均能明显抑制嗜水气单胞菌NQ的增殖,抑制率分别为53.74%和56.12%。不同温度下的抑菌活性试验显示,2种芽孢杆菌的抑菌活性温度分别为32℃和29℃。体内拮抗试验结果表明,巨大芽孢杆菌能显著降低异育银鲫肠道气单胞菌的数量。提示巨大芽孢杆菌可作为潜在的水产专用微生态制剂。     

Effects of Dietary Probiotics on the Growth and Feeding Efficiency of Red Hybrid Tilapia,Oreochromis sp., and Subsequent Resistance to Streptococcus agalactiae

An eight-week trial was performed to evaluate three commercial/prototype probiotics supplemented in red hybrid tilapia, Oreochromis sp. diets. Triplicate groups of tilapia were measured for growth performance, feeding efficiencies, and whole-body composition. After the feeding trial, duplicate groups of tilapia were assessed for their resistance to Streptococcus agalactiae over 23 days. Six diets were supplemented with 0.1% or 0.3% PB₁ consisting of Bacillus subtilis, 0.1% or 0.3% PB₂ consisting of B. licheniformis or 0.1% MPB consisting of Bacillus sp. and Pediococcus sp. Probiotics had no effect (p > 0.05) on growth or feeding efficiencies, although whole-body crude protein was significantly higher in the PB₁ 0.3% treatment. Tilapia in the probiotic treatments had a higher resistance to S. agalactiae and, with the exception of the PB₂ 0.1% diet, were all significantly higher than the control treatment. Although the tested probiotics were not growth promoters, dietary B. subtilis was the most effective prophylactic against pathogenic bacteria.     

中草药复合微生态制剂对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、肠道菌群及抗病力的影响

通过在饲料中分别添加2×107 CFU/g的芽孢杆菌制剂、中草药芽孢杆菌制剂、复合微生态制剂和中草药复合微生态制剂,研究4种微生态制剂对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、肠道菌群及抗病力等的影响。结果显示：(1)饲料中添加4种微生态制剂均可显著提高罗非鱼的增重率(P<0.05),对成活率和饲料利用率也有一定程度的提高(P>0.05),而中草药复合微生态制剂对罗非鱼促进生长效果最佳。(2)饲料中添加4种微生态制剂可以显著提高罗非鱼肠道中的细菌总数、芽孢杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量(P<0.05),大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05),说明饲料中添加一定量的4种微生态制均可改善罗非鱼的肠道菌群结构,以中草药复合微生态制剂的改善效果最佳。(3)经人工感染无乳链球菌后,罗非鱼对照组全部死亡,4个实验组只有部分死亡。鉴定发现,吉富罗非鱼的死亡均由感染无乳链球菌所致,试验组罗非鱼的免疫保护率分别为51.42%(B组)、58.62%(C组)、58.62%(D组)和68.93%(E组),以中草药复合微生态制剂组的免疫保护率最高。综上所述,在饲料中添加一定比例的中草药复合微生态制剂可以提高吉富罗非鱼生长指标、改善其肠道菌群结构和增加抗病力。