6种笛鲷属鱼类线粒体16S rRNA基因片段的序列比较

对笛鲷属(Lutjanus)的紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白星笛鲷(Lutjanus stellatus)、千年笛鲷(Lutjanus sebae)、勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)、红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)线粒体DNA 16SrRNA基因片段进行了PCR扩增和测序，得到长度约418bp的序列。结合GenBank中斜带笛鲷(Lutjanus decussatus)该区段的16SrRNA序列，用(Clustal_X排序软件进行16SrRNA序列的对位排列。通过Mega2．1软件对所得线粒体16SrRNA片段序列进行比较，共检测53个碱基存在变异，其中包括21个简约信息位点，并用“PairWise distance”计算了各属间的相对遗传距离，结果表明，其序列差异(转换 颠换)在0．027～0．083，其中勒氏笛鲷与斜带笛鲷的序列差异最小，红鳍笛鲷与勒氏笛鲷的序列差异最大。以高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外类群，采用Mega2．1软件中的“Neighbore-Joining‘’法得到唯一1个分子系统树，系统树各分支的置信度南“Bootstrap”1000循环检验。结果表明，6种笛鲷鱼类聚成明显的3个分支，第1个分支，包括勒氏笛鲷、斜带笛鲷和白星笛鲷；第2个分支，包括紫红笛鲷；第3个分支，包括红鳍笛鲷和千年笛鲷。     

奥利亚罗非鱼线粒体基因组全序列测定与系统进化分析

采用LA-PCR(long amplification polymerase chain reaction)扩增方法获得奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)线粒体基因组全序列.分析表明,序列全长16 632 bp,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个长度为931 bp的主非编码区.A、T、G、C碱基的组成分别为27.89％、25.50％、15.62％、30.99％.基因排列与罗非鱼属的其他物种一致.13个蛋白质基因除COX1用TGT做起始密码子外,其他均以ATG为起始,终止密码子除COX2、Cyt b、ND4为不完整的T,其余基因均以典型的TAA做终止密码子.22个tRNA的二级结构都具有典型三叶草结构.系统发育分析显示,罗非鱼属与丽鱼科(Cichlidae)其他物种分开,聚为单系群,其中奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,莫桑比克非鱼和罗非鱼KM-2006亲缘关系较近.本研究旨在为进一步利用线粒体基因组分析罗非鱼群体遗传多样性、亲缘关系以及丽鱼科系统进化提供基础依据.     

红鳍笛鲷的人工繁育

红鳍笛鲷属鲈形目、笛鲷科鱼类,又称红笛鲷,广东地方俗称红鱼、红鸡,福建地方俗称：红曹,台湾地方俗称：横笛鲷、赤海鸡、红鸡仔、红沙鱼等。     

紫红笛鲷与红鳍笛鲷5种同工酶的比较研究

采用聚丙烯酰胺垂直平板梯度凝胶电泳的方法,对紫红笛鲷和红鳍笛鲷8种组织中的5种同工酶(EST,LDH,MDH,ME,POD)进行比较研究,对所研究的5种同工酶在两种鱼的组织分布、位点表达及活性作了分析和总结。试验结果表明:两种鱼的ME、MDH同工酶谱非常相似,只在活性上略有差异;EST、LDH、POD等的酶谱表达带型和活性不同,这些酶可作为紫红笛鲷和红鳍笛鲷的遗传鉴定标记,能够将亲缘关系很近的这两种鱼区分开来,从而为形态分类学提供生化依据。     

4种笛鲷属鱼类随机扩增多态性DNA及遗传多样性研究

使用RAPD技术分析了红鳍笛鲷、紫红笛鲷、勒氏笛鲷和约氏笛鲷的种内遗传多样性、种间遗传多样性和种间亲缘关系。在120个随机引物中筛选出扩增效果好的引物36个,平均每个引物在每个个体上产生7．7个条带。种内遗传多样性研究结果显示：遗传距离(D)分别为0．2257,0．2228,0．2679和0．2247;遗传多样性指数(H)分别为0．1854,0．1904,0．2015和0．1865。说明目前湛江近海这4种笛鲷的遗传多样性比较丰富,它们的种质资源仍处于一个良好的水平。种间遗传多样性结果显示：勒氏笛鲷与约氏笛鲷遗传距离(Dpq)最小,亲缘关系最密切,勒氏笛鲷与红鳍笛鲷种间Dpq最大,亲缘关系最远。     

滁州鲫(Carassius auratus)线粒体全基因组序列分析及系统进化

为探讨天然三倍体滁州鲫的系统进化地位,采用直接测序法获得滁州鲫线粒体基因组。其序列全长为16581 bp,碱基组成为31.6% A、26.2% T、16.1% G和26.1% C,包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区,各基因的位置及组成与已公布的鲤科鱼类一致。除tRNA-Ser (AGY)外,其他21个tRNA的二级结构均具有典型的三叶草结构;13个蛋白编码基因中,除COⅠ起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;COⅡ、ND3、ND4和Cytb基因的终止密码子为不完整的T,其他9个基因均具有完整的终止密码子TAA或TAG。序列分析表明,滁州鲫与其他鲫属鱼类(方正银鲫A系和D系、鲫、淇河鲫、萍乡肉红鲫、黑鲫、日本白鲫和日本银鲫)在线粒体基因组上均具有较高的序列同源性(>94%)。以鲤(Cyprinus carpio haematopterus)为外类群,基于线粒体13个蛋白质基因的核苷酸与氨基酸序列构建上述鲫属鱼类的系统进化树,结果显示,滁州鲫与方正银鲫亲缘关系最近,与黑鲫最远。综合以上研究结果,认为滁州鲫应为银鲫亚种的一个地方种群。     

鲂属鱼类线粒体基因组的比较及其系统发育分析

基于GenBank中团头鲂线粒体基因组全序列和三角鲂、厚颌鲂、广东鲂的部分线粒体基因组序列,设计引物扩增出三角鲂、厚颌鲂和广东鲂3种鱼线粒体基因组全序列,同时对4种鲂属鱼类线粒体基因组全序列进行了比较分析。结果表明,4种鲂属鱼类线粒体基因组基因排列顺序完全相同,排列紧密,均包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA、1个非编码控制区(D-loop区)和1个轻链复制起始区(OL区)。除ND6和8个tRNA在L链上编码外,其余的基因均在H链上编码。4种鲂属线粒体基因组13个蛋白质编码基因中,均呈现出较强的A+T偏向性和C碱基偏好。全序列比对结果显示,共有758个变异位点,其中非简约性信息位点有691个,占总变异位点的91.16%,简约性信息位点有67个,仅占总变异位点的8.84%。22个tRNA基因中只有11个存在种间变异,共23个变异位点,主要发生在tRNA三叶草结构的TΨC和DHU臂环上。13个蛋白质编码基因中共检测出626个变异位点,这些变异主要发生在密码子第三位,占总变异位点的82.59%,其中变异位点数最多的是Cyt b基因,达84个,其次是ND 4基因(83个)。因此,Cyt b和ND4基因可作为备选的分子标记,用于鲂属群体间的遗传学研究。基于4种鲂属鱼类线粒体基因组全序列构建的ML树和BI树均显示,三角鲂与厚颌鲂的亲缘关系最近,团头鲂与它们的亲缘关系相对较近,而广东鲂与前述3种鲂属鱼类的亲缘关系均较远。     

红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势的微卫星标记分析

利用12对微卫星引物对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)及其红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代(F1)3个群体进行扩增,对3个群体的等位基因频率、群体多态信息含量、有效等位基因数、杂合度、Shannon信息指数及群体间遗传距离进行了遗传检测,共检测到29个等位基因,平均每个基因座位2.4167个等位基因。红鳍笛鲷、F1、千年笛鲷3个群体的多态信息含量分别为0.3484、0.5008、0.4097;有效等位基因数分别为1.9787、2.5074、2.1334;杂合度分别为0.6548、1.0000、0.7384;Shannon信息指数分别为0.6207、0.9240、0.6957。红鳍笛鲷(♀)-F1、F1-千年笛鲷(♂)、红鳍笛鲷(♀)-千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.3116、0.2346、0.7813。多态信息含量、有效等位基因数、杂合度、Shannon信息指数均显示F1代有杂种优势。     

基于COⅠ基因的中国及邻近海域部分笛鲷属鱼类DNA条形码研究

笛鲷属(Lutjanus)鱼类经济价值高,物种数量多,但外部形态保守,传统分类鉴定困难。为了解中国笛鲷属鱼类的物种多样性状况,测定了中国沿海19个地点11种笛鲷73个样本线粒体COⅠ基因5'端序列,并与从GenBank下载中国及邻近海域69条同源序列进行DNA条形码分析。研究表明,勒氏笛鲷(L. russelli)、金焰笛鲷(L. fulviflamma)、奥氏笛鲷(L. ophuysenii)、约氏笛鲷(L. johni)、蓝点笛鲷(L. rivulatus)、五线笛鲷(L. quinquelineatus)、千年笛鲷(L. sebae)、紫红笛鲷(L. argentimaculatus)、白斑笛鲷(L. bohar)、马拉巴笛鲷(L. malabaricus)、黄笛鲷(L. lutjanus)、印度笛鲷(L. indicus)、画眉笛鲷(L. vitta)、星点笛鲷(L. stellatus)、四带笛鲷(L. kasmira)、驼背笛鲷(L. gibbus)、焦黄笛鲷(L. fulvus)、红鳍笛鲷(L. erythopterus)等18种笛鲷142条COⅠ序列组成18个自展数据支持率(bootstrap)为99%～100%的单系分支,分支间平均遗传距离14.4%(2.9%～21.8%)约为分支内平均遗传距离0.17%(0～0.6%)的85倍,其中10种笛鲷独立成支,支持其物种有效性。勒氏笛鲷分成2小支,小支间平均遗传距离(2.9%)是小支内平均遗传距离(0.5%)的5.8倍,未满足"10×法则",其准确的物种分类地位尚待明确。印度笛鲷与勒氏笛鲷、画眉笛鲷与奥氏笛鲷出现混杂,推测从GenBank下载的印度笛鲷序列KF830898和KF830905可能来自勒氏笛鲷;画眉笛鲷序列KU943888可能来自奥氏笛鲷。中国近海星点笛鲷和蓝点笛鲷混杂且种间遗传距离仅为2.1%,接近一般种内遗传距离2%;红鳍笛鲷和马拉巴笛鲷遗传距离种间(0.3%)与种内(0.2%～0.3%)相当,且形态相似,推测是同一物种,也不排除它们存在种间杂交和为近期分化物种的可能。     

斑石鲷和条石鲷线粒体基因组密码子使用分析

为研究石鲷科中斑石鲷和条石鲷线粒体基因编码序列密码子的使用模式和特性,进而探讨这2种鱼与其他水生动物的亲缘关系,以期为探讨2种鱼类间的近缘杂交育种、种质资源等研究提供理论依据。在美国国立生物技术信息中心GenBank数据库中搜索并下载斑石鲷、条石鲷、斑马鱼、金鼓鱼、黑鲷和真鲷6种鱼线粒体基因序列,以CodonW、SPSS等软件采用生物信息学方法对斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质的基因序列进行分析,通过相对密码子使用度以及对密码子的偏好性和基因序列进行相关性和聚类分析,进而探讨其亲缘关系。研究结果表明,斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质的基因偏爱使用AC结尾的密码子,UUC、ACC等密码子为斑石鲷和条石鲷线粒体DNA编码蛋白质基因的偏好性密码子。在基因序列及偏好密码子聚类中,斑石鲷与条石鲷、黑鲷与真鲷均首先聚为一类,亲缘关系最近,这与传统分类学一致;斑石鲷和条石鲷与斑马鱼的遗传距离最远,亲缘关系最远。     

长江刀鲚寄生的异钩铗虫分子鉴定及形态学研究

为了获知长江刀鲚寄生的异钩铗虫的分类学地位,采用光学、扫描电子显微镜和分子遗传扩增28S rRNA基因5’端部分序列相结合的方法,对长江刀鲚寄生的异钩铗虫进行种属鉴定和形态学研究。结果显示,后吸器与体前区分不明显,含有四对不对称的吸铗,其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗,虫体尾部带有二对端钩,卵两端具有较长的极丝。序列分析显示,林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫相似度为100%,邻接法构建分子进化树中处在同一分支。经形态及分子综合分析鉴定,此寄生虫为林氏异钩铗虫。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析

利用特异性引物,采用PCR扩增出分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株的cpsE基因,将其克隆到pMD19-T载体上,通过菌落PCR鉴定和利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定之后送测序公司测序,并利用生物信息学软件Clustal X 2.0、MEGA 4.1、Bioedit 7.0、TMHMM、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0、SignalP 3.0 Server、PSIpred、SAM_T08以及CUSP等分析cpsE基因的分子特性。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌cpsE编码氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%,具有1个参与催化糖基元转运的Glycosyltransferases超级家族结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,且存在跨膜区。密码子偏爱性分析表明,罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性更接近真核生物。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

养殖银鲳虹彩病毒感染的组织病理学分析及分子检测

2018年7月,宁波象山某养殖场内银鲳出现集中死亡现象,累积死亡率高达80%以上,为探究此次疾病暴发的原因,本研究通过对患病银鲳进行组织病理学分析、透射电镜观察、病原的分子生物学检测及分析来对其病原进行鉴定,以便制定合理的防控措施。患病银鲳临床表现为厌食、身体失衡、脾脏肿大、肝脏颜色异常等病征。组织病理学观察发现,患病银鲳肝脏、脾脏和肾脏均出现直径10～15μm、细胞质嗜碱性的肿大细胞。进一步的透射电镜观察则在脾脏、肾脏等组织细胞内发现了病毒包涵体结构以及大量的病毒粒子,直径为140～160 nm。通过虹彩病毒特异性PCR检测发现,患病组织样品为虹彩病毒阳性。此外,通过病毒主要衣壳蛋白基因(MCP)序列分析,发现银鲳源病毒与大黄鱼虹彩病毒(GenBank登录号:AY779031.1)MCP同源性最高为99.76%,认为此分离病毒属于虹彩病毒科、肿大细胞病毒属、真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)类群。本实验首次报道了全人工养殖环境下银鲳感染虹彩病毒的病例,该研究将为养殖银鲳虹彩病毒病的诊断和防治提供重要的参考依据。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法,首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟,中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD, 896 kD和924 kD;3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD,都具有29 kD的轻链,其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明,3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性,在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别,而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示,3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应,但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应,这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的,而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

近江蛏精子超微形态结构观察及与缢蛏精子的比较

利用扫描电镜和透射电镜分别观察了近江蛏和缢蛏成熟精子的超微形态结构。发现近江蛏精子与缢蛏精子在超微形态结构上差异很大。近江蛏精子为典型的原生型,成熟精子由头部、中段和尾部组成,头部包括顶体和细胞核。近江蛏精子与缢蛏精子顶体均为保龄球状,但近江蛏精子顶体全长比缢蛏短。近江蛏精子细胞核略扁圆形,外缘具8～9个圆弧形凸起;缢蛏精子细胞核则呈圆球状。近江蛏精子中段由线粒体和中心粒复合体构成,线粒体一般5个,个别4～6个;缢蛏线粒体5个或6个。近江蛏精子尾部为细长的鞭毛,轴丝为“9 2”结构,与缢蛏的相同。从近江蛏与缢蛏的精子形态差异看,两者应属于种间差异。     

浒苔对赤潮异湾藻的克生作用

研究了浒苔对赤潮微藻—— 赤潮异湾藻生长的克生效应。结果表明, 浒苔新鲜组织对赤潮异湾藻的生长具有强烈的克生效应; 一次性添加浒苔培养过滤液对赤潮异湾藻生长没有显著的抑制作用, 而半连续添加浒苔培养过滤液对赤潮异湾藻生长具有显著的克生作用; 浒苔干粉末和甲醇抽提液均对赤潮异湾藻的生长产生显著的抑制作用。试验结果表明, 抑制赤潮异湾藻生长的物质很可能更多地存在于浒苔组织内, 向环境中分泌的克生物质较少。因而, 克生物质的连续分泌是有效克制赤潮异湾藻生长的关键。同时, 克生作用存在着明显的浓度效应, 当抑制物浓度达到一定阈值才表现出明显的克生作用, 在阈值之上浓度越高克生作用越强。