厚壳贻贝抗菌肽Mytilin的初步鉴定

厚壳贻贝是我国具有重大经济价值的水产养殖贝类,对其抗菌肽的研究有助于人们了解厚壳贻贝的免疫机制。为了解厚壳贻贝血清中抗菌肽Mytilin的分子组成和特性,采用多维高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,从中获得3种对革兰氏阳性菌以及阴性菌均有抑制作用的抗菌肽分子,序列分析表明3种抗菌肽具有较高的序列相似性,均属于贻贝抗菌肽Mytilin家族,分别命名为Mytilin-1,Mytilin-2和Mytilin-3。其中,Mytilin-1为34个氨基酸残基构成的多肽,其分子量为3885.17u,含8个半胱氨酸,形成4对二硫键。根据所测Mytilin-1的氨基酸序列设计特异性引物,通过菌落PCR方法筛选厚壳贻贝cDNA文库,获得Mytilin-1的cDNA基因并进行了序列分析。以上研究结果表明,作为贻贝的主要抗菌肽家族,Mytilin在厚壳贻贝血清中具有较高丰度,对其蛋白质序列以及基因序列的研究为深入了解厚壳贻贝Mytilin抗菌肽的分子多样性奠定了基础。     

厚壳贻贝M7 lysin分子的克隆与表达

M7 lysin位于贻贝精子顶体中,是溶解卵黄膜、促进受精作用的重要蛋白质,决定了贻贝种间精卵识别的特异性。采用同源克隆法得到厚壳贻贝M7 lysin分子,并在原核生物中对该分子进行重组表达。结果表明,扩增产物为540 bp左右的片段,进一步测序发现其开放阅读框cDNA为543 bp,与贻贝、地中海贻贝、盖勒贻贝具有较高的相似性;在线翻译所得蛋白质片段中含有180个氨基酸,分子量为20 ku,等电点为8.48;通过M7 lysin氨基酸序列构建系统进化树发现,贻贝和地中海贻贝亲缘关系最近,其次为盖勒贻贝,最后是厚壳贻贝;将 M7 lysin分子在E.coli Rosseta(DE3)中融合表达,得到包括载体氨基酸序列在内的25 ku蛋白质,符合预期分子质量。     

厚壳贻贝5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)基因克隆和时空表达

为探究5-羟色胺2A受体（5-HT 2A receptor， 5-HT2AR）基因在海水贝类生长发育中的作用，本研究通过RACE技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）克隆了厚壳贻贝5-HT2AR 基因的cDNA全长，并分析该基因的时空表达。结果显示，5-HT2AR基因全长2 636 bp，开放阅读框（ORF）2 124 bp，共编码707个氨基酸。序列分析结果显示该序列与人、小鼠、斑马鱼、长牡蛎和虾夷扇贝等物种分别具有45%、45%、48%、49%和67%的同源性。厚壳贻贝雌雄成体各组织和器官中均有5-HT2AR基因表达，雄性中的鳃表达量最高，而在雌性鳃、外套膜和性腺中的表达稍高于其他组织和器官；推测该基因可能与厚壳贻贝的摄食、对外界环境的感知及促进卵母细胞成熟有关。5-HT2AR基因在厚壳贻贝各发育阶段均有表达，且稚贝的表达量为眼点幼虫的1.4倍，推测5-HT2AR基因可能参与了调控厚壳贻贝幼虫的生长发育过程。本研究为进一步了解5-HT基因家族在双壳贝类中的功能奠定了基础。     

厚壳贻贝与贻贝遗传渐渗的分子生物学鉴定

本文运用ISSR标记对厚壳贻贝与贻贝遗传渐渗进行研究。结果表明,厚壳贻贝与贻贝的特异性标记在杂交贻贝中有所反应,进一步证实了在浙江嵊泗部分厚壳贻贝与贻贝发生了杂交和基因渐渗现象。所采集的杂交群体样本中,65%与厚壳贻贝的遗传距离近,可能是杂交后与厚壳贻贝回交的后代。目前由于过度采捕、环境改变以及引进外来种等影响,应该对厚壳贻贝的种质资源进行保护。     

真鲷鳃组织cDNA文库的构建与hepcidin抗菌肽基因序列的扩增

以细菌攻毒的真鲷鳃组织为材料，分离出mRNA，合成双链后，回收500～4 000 bp cDNA片段，构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的容量为1.75 ×105个重组子，扩增文库的滴度达到1×10⁹ pfu·mL^-1，随机挑选噬菌斑的插入片断在500～2000 bp之间。以hepcidin特异性引物做PCR扩增文库，获得了hepcidin抗菌肽基因cDNA序列，证明所建立的文库可用于免疫相关基因的筛选。本文库可作为筛选真鲷免疫相关基因的重要资源。     

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达

为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。     

生态因子对厚壳贻贝眼点幼虫生长和存活的影响

为了实现厚壳贻贝人工育苗技术突破和推广,研究了海水盐度、温度、pH等生态因子对厚壳贻贝眼点幼虫的生长和存活的影响,筛选出最佳的繁育条件.结果表明:厚壳贻贝眼点幼虫对盐度的适应范围为23.5～39.1,最适为27.4～35.3;对温度的适应范围为18～27℃,最适为21～24℃;对pH值的适宜范围为7.5～9.0,最适为7.8～8.5.掌握了厚壳贻贝眼点幼虫对主要生态因子的适应范围,对厚壳贻贝人工育苗技术的突破具有重要的指导意义.     

杂交贻贝同工酶表达的初步分析

运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对2种贻贝(厚壳贻贝、紫贻贝)稚贝及通过人工培育所得的二者的杂交后代稚贝同工酶表达状况进行分析.结果显示,所检测5种酶(SOD、MDH、ME、ATP、ADH)在上述3种贻贝中的表达极为相似,MDH在3种贻贝中除r迁移率相同的条带外,在紫贻贝中表达出迁移率较小、表达较弱的条带;SOD和ATP仅在厚壳贻贝中表达出比另外2种多1条迁移率最大的条带,ME则表现为紫贻贝少1条中间的条带,ADH在杂交贻贝和紫贻贝中表达完全相同,厚壳贻贝虽也表现为3条酶带,但迁移率明显不同.试验结果说明,厚壳贻贝和紫贻贝具有较近的亲缘关系,其杂交后代与二者均有一定的相似性,这与传统的分类方法所得的结论相一致.     

热休克及菌胁迫对厚壳贻贝HSP70基因表达的影响

70 ku的热激蛋白(HSP70)具有细胞内分子伴侣和细胞外免疫调节功能,是受到热激、重金属、干旱、疾病、寄生虫感染等条件胁迫后产生的诱导蛋白。本实验利用同源克隆法,获得厚壳贻贝HSP70基因1 700 bp的核心序列,BLAST比对和系统进化分析显示,该序列与已知的双壳贝类相应分子高度同源,其中与紫贻贝HSP70基因相似性高达96%,在进化树中两者位于同一分支。37 ℃热激后,厚壳贻贝肝胰腺和鳃中HSP70基因的表达快速上调,2 h即达到对照组30倍,随后持续上升,肝胰腺中最高表达量达到对照组100倍,说明厚壳贻贝HSP70分子为典型的热诱导蛋白。鉴于大肠杆菌及枯草芽孢杆菌是水体中常见微生物,进一步利用实时荧光定量PCR技术检测上述两种细菌感染后,HSP70基因在厚壳贻贝鳃和肝胰腺中的表达水平,结果显示,两种细菌均可引起厚壳贻贝鳃和肝胰腺的HSP70基因表达上升,但大肠杆菌诱导效应显著,8 h时表达量达到最高,鳃为对照组的4倍,肝胰腺为4.5倍,随后逐渐下降,到48 h已恢复到原始水平;枯草芽孢杆菌刺激后,肝胰腺组织中最高表达量在刺激后6 h约为对照组2.5倍,与注射PBS的效果相差不大,鳃组织的响应较肝胰腺组织明显,表达量缓慢升高,8 h达到最高,为对照组4倍,随后迅速下降,直至生理水平。研究表明,厚壳贻贝HSP70分子在调节环境胁迫及宿主免疫防御中具有重要功能。     

海洋贝类Toll样受体及信号通路的研究进展

Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是模式识别受体家族(PRR)中重要的一员,它可以特异地识别病原体相关的分子模式(PAMP),激活信号级联、诱发固有免疫反应,在抵御病原微生物过程中发挥重要作用。TLRs最早在果蝇胚胎中发现,是一类进化高度保守的免疫受体家族,在果蝇及脊椎动物中研究得较为透彻。海洋贝类具有较高的经济价值及重要系统进化地位,近年来,大量贝类的Toll样受体及信号通路相关因子被发现。本文综述了Toll样受体的结构、信号通路和海洋贝类TLR及信号通路相关因子的研究进展,有助于丰富海洋贝类固有免疫理论研究。     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal)的重组表达及活性分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal, GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。     

Lysozyme: an important defence molecule of fish innate immune system

The innate immune system of fish is considered to be the first line of defence against a broad spectrum of pathogens and is more important for fish as compared with mammals. Lysozyme level or activity is an important index of innate immunity of fish and is ubiquitous in its distribution among living organisms. It is well documented that fish lysozyme possess lytic activity against both Gram‐positive bacteria and Gram‐negative bacteria. It is also known to be opsonic in nature and activates the complement system and phagocytes. It is present in mucus, lymphoid tissue, plasma and other body fluids of freshwater and marine fish. It is also expressed in a wide variety of tissues. Lysozyme activity has been shown to vary depending on the sex, age and size, season, water temperature, pH, toxicants, infections and degree of stressors. Here, we review our current understanding of different types of lysozyme and their expression and its role in fish innate immune system.     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。     

鱼类免疫应答机制研究进展

鱼类免疫应答可以分为固有免疫和适应性免疫,但固有免疫发挥主要作用。固有免疫对病原体的识别是通过模式识别受体PRR与病原相关分子模式PAMP的相互结合实现,这与哺乳类相似。但为适应水生生活,鱼类固有免疫对PAMP的识别范围更广,免疫应答的启动条件更低。固有免疫的效应细胞主要是单核/巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞等,具有吞噬和杀伤功能,还可分泌多种免疫相关的细胞因子,介导发生炎症反应。适应性免疫中,T淋巴细胞通过抗原提呈细胞分解吸收抗原,由主要组织相容性复合物(MHC)类分子递送到细胞表面才能识别。B淋巴细胞分泌产生以免疫球蛋白Ig M为主的抗体分子,而发挥抗体中和作用及免疫调理作用的Ig G在鱼类中比较少见,说明鱼类抗体的免疫功能还处于较低水平。本文综述了近二十年内鱼类免疫应答机制的相关研究进展,为进一步了解鱼类免疫应答机制提供参考。     

Identification of MDP (muramyl dipeptide)-binding key domains in NOD2 (nucleotide-binding and oligomerization domain-2) receptor of Labeo rohita

In lower eukaryotes-like fish, innate immunity contributed by various pattern recognition receptor (PRR) plays an essential role in protection against diseases. Nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-2 is a cytoplasmic PRR that recognizes MDP (muramyl dipeptide) of the Gram positive and Gram negative bacteria as ligand and activates signalling to induce innate immunity. Hypothesizing a similar NOD2 signalling pathway of higher eukaryotes, the peripheral blood leucocytes (PBLs) of rohu (Labeo rohita) was stimulated with MDP. The data of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) revealed MDP-mediated inductive expression of NOD2 and its down-stream molecule RICK/RIP2 (receptor-interacting serine-threonine protein kinase-2). This observation suggested the existence of MDP-binding sites in rohu NOD2 (rNOD2). To investigate it, 3D model of ligand-binding leucine-rich repeat (LRR) region of rNOD2 (rNOD2-LRR) was constructed following ab initio and threading approaches in I-TASSER web server. Structural refinement of the model was performed by energy minimization, and MD (molecular dynamics) simulation was performed in GROMACS (Groningen Machine for Chemical Simulations). The refined model of rNOD2-LRR was validated through SAVES, ProSA, ProQ, WHAT IF and MolProbity servers, and molecular docking with MDP was carried out in GOLD 4.1. The result of docking identified LRR3-7 comprising Lys820, Phe821, Asn822, Arg847, Gly849, Trp877, Trp901 and Trp931 as MDP-binding critical amino acids in rNOD2. This is the first study in fish to provide an insight into the 3D structure of NOD2-LRR region and its important motifs that are expected to be engaged in MDP binding and innate immunity.     

金属蛋白酶组织抑制剂在皱纹盘鲍抗弧菌免疫中的作用

由弧菌感染引起的疾病是影响鲍存活率的主要因素,实验以皱纹盘鲍为研究对象,探讨金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)在皱纹盘鲍抗弧菌免疫中的功能及其与基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1, MMP-1)的相互作用关系。实验通过PCR技术克隆得到了TIMP cDNA序列,全长为2 291 bp。利用NetNGlyc 1.0Server和NetOGlyc 4.0 Server软件对TIMP的氨基酸序列进行分析,结果显示,TIMP有3个潜在的N-糖基化位点,分别位于第47、77和152位的Asn,以及一个潜在的O-糖基化位点,即位于第108位的Thr。多序列比对结果显示,皱纹盘鲍TIMP氨基酸序列与杂色鲍、太平洋牡蛎、泥蚶中TIMP的序列相似性分别为76.0%、18.9%和19.3%。利用荧光定量PCR技术分析了副溶血性弧菌感染过程中皱纹盘鲍不同组织中TIMP的表达情况,发现在弧菌感染早期,TIMP在血淋巴细胞和鳃组织中的表达量均显著上调。利用RNA干扰技术分别敲低皱纹盘鲍TIMP和MM...     

DAD1和AIF-1细胞因子在鱼类中的研究进展

细胞因子是一类由多种细胞合成或分泌的可溶性蛋白与多肽物质,具有调节多种细胞生理功能的作用.抗细胞凋亡因子(DAD1)是一种内源性细胞凋亡抑制基因.同种移植炎症因子(AIF-1)是一种由干扰素r诱导的钙离子结合蛋白.本文概述了DAD1和AIF-1的结构特点、功能表达、生物学作用及在水产动物中的最新研究进展,旨在为水产动物细胞因子的研究和有效应用提供参考资料.