纯化病毒复制中华绒螯蟹“颤抖病”的组织病理观察

采用石蜡切片及超薄切片技术，对人工感染纯化病毒后具典型颤抖症状的中华绒螯蟹进行病理学观察。结果显示：人工感染“颤抖病”病毒发病与自然发病的病理变化相似，病蟹的肝胰脏、鳃、心脏及腹神经节等组织器官发生了病变，其病理特征主要表现为细胞浊肿、变性、坏死，某些细胞的细胞核固缩、碎裂或崩解；超薄切片电镜下可见细胞内存在病毒样颗粒，线粒体内嵴受损严重。病变严重的区域，组织细胞坏死，结构崩解。提示肝胰脏、鳃、心脏及神经组织是病毒感染主要靶器官。     

真鲷幼鱼狂游症病毒病原学初步研究

应用电子显微镜观察真鲷幼鱼内脏组织超薄切片。发现真鲷幼鱼脾脏存在大量病毒颗粒。病毒颗粒直径约１２０ｎｍ，呈六角形，有一层蛋白质外壳。核心主要为核心酸。病毒颗粒主要位于细胞核内。感染的细胞肿胀，比正常细胞增大５－６倍。在肠组织超薄切片中也发现少量形态相同的病毒颗粒。     

中华绒螯蟹颤抖病病原的初步研究

本文作者将发生颤抖病的中华绒螯蟹内脏匀浆，３００００ｒ．ｐ．ｍ离心３０分，将沉淀重悬，细菌过滤器过滤后，注射病蟹内脏接种健康的中华绒螯蟹进行人工感染试验，感染蟹表现出与野外发病中华绒螯蟹同样的症状。超薄切片后，电子显微镜下在细胞质中可观察到病毒样颗粒及略小于细胞核大小的病毒包埋体样结构。     

草鱼出血病病毒的电子显微镜观察初报

<正> 据报道草鱼出血病是由病毒引起的,在病鱼的肾组织及头肾组织超薄切片中均发现有疱疹病毒颗粒。我们将草鱼出血病病鱼的组织匀浆,经分离、提纯后,用2%磷钨酸溶液,pH6.9负染色,在电子显微镜下观察到一种病毒颗粒(图1)。颗粒呈球形,直径为60-70毫微米,有些颗粒可见直径为30-40毫微米左右的核心及20-30毫微米的外膜。用上述提纯样品感染2-3寸健康二龄草鱼,饲养水温保持在28℃左右,可以使之发病。将病鱼的肝、脾、肾取出后,研磨、冻融、离心后,制备成1%的病毒悬液,用此悬液感染鱼肾单层细胞,细胞收缩、脱落,出现病变。病变细胞经超薄切片观察,我们初次在组织培养的鱼肾细胞质内见到上述的病毒颗粒(图2)。有时可见到这类病毒颗粒包裹在膜状结构,而成从出现(图3)。另外,尚可见到未包裹上外壳的核心颗粒及外膜尚不明显     

海湾扇贝面盘幼虫“面盘解体病”病原的研究

对大连地区患"面盘解体病"的海湾扇贝(Argopecten irradians)面盘幼虫进行电镜观察,并对健康海湾扇贝幼虫进行人工感染实验.患该病面盘幼虫病症为:下沉,组织解离,游泳器官面盘解体,经过一段时间后全部死亡.对发病面盘幼虫进行超薄切片电镜观察发现,该病原病毒主要侵染面盘幼虫的结缔组织细胞和上皮细胞,病毒呈六角形或近圆形,未成熟病毒颗粒直径为84～90 nm,病毒颗粒形态不一,大致有4种与所报道的鸡马立克氏病毒(Marek's disease herpes virus)和火鸡疱疹病毒(Turkey herpes virus)相似,即致密拟核型、中空型、十字型和双环型.从形态学上进行鉴定,认为该病毒属于疱疹样病毒(Similar herpesvirus).人工感染实验显示,在感染病毒后100 h,有30%幼虫出现"面盘解体"病状;感染148 h,幼虫全部死亡(水温22～24 ℃).根据实验结果推断,病毒的传播途径包括垂直传递和水平传播.     

大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究

目的:探索大黄鱼幼鱼夏季高温病流行的病毒性病原体。方法:应用电子显微镜观察大黄鱼幼鱼内脏组织超薄切片。结果:发现大黄鱼幼鱼脾脏细胞肿胀,细胞内存在大量虹彩病毒颗粒。病毒颗粒直径约120nm,呈六角形,有一层蛋白质外壳,核心为核酸。病毒感染主要位于细胞质内。结论:大黄鱼幼鱼脾细胞感染的病毒是虹彩病毒,虹彩病毒感染及环境因素可能是导致大黄鱼幼鱼夏季高温病暴发流行并致死的主要原因。     

一种杆状病毒及其与细菌对两种养殖对虾的致病性

近几年来,养殖对虾发生了严重流行性虾病,经对病虾肝胰腺、胃、肠、鳃等部位进行超薄切片电镜观察和分离提纯,发现有大量杆病毒和细菌感染。超薄切片显:病毒粒子短杆状、两端钝圆、具羹膜、大小约250—310mm×90—110mm,提纯的核衣壳大小约300—320mm×70mm。将粗提纯的病毒和细菌口饲感染健康的日本对虾和长毛对虾,可同时引起对虾发病死亡,病毒感染8天后引起的死亡率分别是50％和41.7％,病毒与细菌共感染8天后的死亡率比前者高。这些结果说明:所分离的杆状病毒是日本对虾和长毛对虾的共同病原,在它们之间具有流行性,而细菌与这种病毒对虾体的共同侵染,造成更高死亡率。     

草鱼呼肠孤病毒JX-0902株的分离和鉴定

收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0902)基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征,但基因组带型与GCRV 873株存在差异,而与HZ08株接近。根据GenBank上已提交的草鱼呼肠孤病毒S6序列(GQ896337)设计特异引物,以JX-0902株的cDNA作为模板,可扩增出特异性条带。基于S6序列的聚类分析结果显示,JX-0902与GCRV HZ08株、GD108株S6同源性高达98%、99%,该分离株应为草鱼呼肠孤病毒。     

大鲵虹彩病毒的形态结构及其包涵体特征

运用电镜和免疫荧光技术,对纯化的大鲵(Andrias davidianus)虹彩病毒粒子、感染病毒的EPC细胞以及确诊感染病毒的病鲵组织样品进行观察和分析。结果表明,纯化的大鲵虹彩病毒负染后电镜下显示球形结构,具囊膜,直径约150 nm;感染EPC细胞中的病毒颗粒呈典型的正二十面体结构,由核衣壳和核心构成,核衣壳呈正六边形,对角直径为(150±5)nm(N=30),核衣壳厚度约5 nm,核心直径为(98±18)nm(N=27)。在病鲵病变的肺和肾组织中发现存在大量聚集或分散的病毒颗粒,其形态特征和感染EPC细胞超薄切片观察的结果一致。免疫荧光电镜观察结果显示,感染病毒的细胞可观察到明显的红色荧光信号,且呈斑块状分布,大小不等。综合大鲵虹彩病毒初步的形态发生和免疫荧光观察结果,认为病毒感染细胞后在不同的发生时期会形成不同类型的病毒包涵体。     

鲤病毒病原的感染性测定

为查明养殖鲤（Cyprinus carpio）突然大批发病死亡的原因，对鲤病样品进行了细胞攻毒、空斑测定、电镜观察，以及鱼体感染等实验。先以患病鲤的组织匀浆液，经过滤后，分别接种到草鱼鳍条细胞（GCF）、鲤上皮瘤细胞（EPC）等14种培养细胞中。利用倒置显微镜观察显示，在1-2d内，该病鱼组织匀浆液可使其中9种细胞出现典型的细胞病变。收集出现病变的细胞液（即病毒悬液），进一步进行病毒滴度检测、空斑测定和鱼体感染实验。结果显示，在GCF细胞上的病毒滴度为10^7.3TCID50／mL；在FHM，TSB和GCO等细胞中可产生直径1～4mm的圆形空斑，空斑的大小与宿主细胞的种类和接种的病毒浓度有关。通过对感染细胞制备的超薄切片和病毒负染样品进行电镜观察，显示这是一类呈典型子弹头样的弹状病毒颗粒。感染了病毒悬液的鲫和鲤先后在第2天和第3天开始出现病症，间隔1～2d后发病的鱼开始死亡，至第14天，两种感染鱼的死亡率均达到83．3％。收集人工感染后濒死的鲫和鲤，分别制备组织匀浆液，回接感染鱼类培养细胞，24h内能使其出现与原发病鲤组织匀浆液所引起的类似的细胞病变。因此证实患病鲤是由病毒病原感染所致。[中国水产科学，2006，13（4）：617—623]     

栉孔扇贝一种球形病毒的分离纯化及其超微结构观察

栉孔扇贝是我国北方沿海贝类养殖的重要经济种类 ,目前已成为我国北方海洋经济的支柱性产业之一。但随着近年来病害的不断加剧 ,养殖期栉孔扇贝的大规模死亡现象频繁发生 ,极大地威胁着这一产业的可持续发展。因此 ,国内围绕扇贝大规模死亡的致病因子及病原学的探讨已引起养殖界各方的高度关注[1-4] 。2 0 0 0年我们对山东省内主要扇贝养殖海区开展了系统的病原学和流行病学调查。通过病贝组织超薄切片的电镜观察 ,在病害高发期的病贝体内大量发现一种球形病毒样颗粒。在此基础上 ,我们进一步完成了该病毒粒子的分离和纯化 ,现将有关结果报…     

牡蛎疱疹病毒对魁蚶的致病性

为探明牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)对魁蚶的致病性,本研究使用发病魁蚶组织制作病毒悬液进行感染实验。感染实验分为空白组、阴性悬液注射组和病毒悬液注射组,并使用实时定量PCR法对感染后魁蚶体内病毒的时空分布进行检测。实验结果显示,空白组和阴性悬液组魁蚶感染后未检测到病毒粒子,病毒悬液注射组魁蚶经人工感染后,各部位病毒含量均呈先上升再下降随后又上升的趋势,最终达到106拷贝/ng DNA左右。通过电镜观察,在感染魁蚶的鳃、肝胰腺、外套膜中出现染色质边缘化甚至消失,细胞核肿胀、溶解,核仁消失,核膜扩张、不清晰,线粒体肿大,脊崩解,核糖体脱落等一系列细胞病理变化。在其细胞核和细胞质中均能发现大量直径为90~110 nm球形病毒粒子,该病毒粒子具囊膜,囊膜内可见均匀高电子密度的核衣壳,与自然发病魁蚶负染电镜中的病毒粒子形态相同。研究结果表明,Os HV-1可以感染魁蚶并与魁蚶大规模死亡有直接相关关系;魁蚶感染Os HV-1后机体产生应激反应,对Os HV-1有一定抑制作用,但其作用机制还有待进一步实验验证。     

魁蚶各组织溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应

为了有效防治细菌及其他病原微生物对魁蚶等贝类的危害,本实验研究了魁蚶各组织中溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应过程,以期探讨魁蚶体内溶菌酶的免疫功能。本实验采用注射活菌的方法侵染20月龄魁蚶个体,随机选取16只个体,在每只个体的斧足处注射1 mL(约1×10~9个)鳗弧菌菌悬液作为感染组;随机选取16只个体不注射鳗弧菌作为对照组。两组魁蚶分别于洁净海水中暂养4、12、24和48 h后,每组随机取4只魁蚶个体的血液、外套膜、鳃、斧足、肝胰腺和闭壳肌等组织,采用ELISA试剂盒测定其溶菌酶含量变化。结果显示,对于鳗弧菌的侵入,魁蚶血液中溶菌酶含量由正常低值迅速增高并一直维持较高的含量,说明血液是魁蚶机体防御病原菌的主要免疫组织之一;魁蚶外套膜在无感染的情况下,对外界水环境的干扰始终保持较高的溶菌酶含量;鳃、斧足的溶菌酶含量均在注射细菌24 h之后明显高于正常值,说明外套膜、鳃、斧足作为魁蚶机体与外界接触的第一道屏障也能应对病原菌入侵,但反应较血液延迟;肝胰腺和闭壳肌的溶菌酶含量变化不明显,推测肝胰腺和闭壳肌不是魁蚶的重要免疫组织或器官。本实验结果可为魁蚶抗病选育及免疫机理方面的研究提供相关的参数。     

小片与蚌间的关系对珍珠质量的影响

本研究采用褶纹冠蚌同一个体自体外套膜小片育珠,结果珍珠质量明显提高。采用三角帆蚌制取外套膜小片植入褶纹冠蚌。结果珍珠质量极差,大多数蚌产不出珍珠;采用褶纹冠蚌制取外套膜小片植入三角帆蚌,结果三分之一的蚌能得到质量高于褶纹冠蚌,产量高于三角帆蚌的珍珠。作者认为供片蚌和受片蚌间相适关系影响珍珠质量,研究如何提高褶纹冠蚌小片在三角帆蚌体内成珠的比率,在生产上是很有意义的。     

文蛤浮游期发病幼虫细菌群落分析和致病菌的分离鉴定

为研究文蛤育苗过程中幼虫病害及其主要致病菌，实验通过构建细菌16S rDNA克隆文库、病原菌分离纯化、人工感染和药敏实验等方法对育苗场发病的浮游期文蛤壳顶幼虫样品进行了系统分析。结果显示，发病的文蛤壳顶幼虫细菌群落多样性低，地中海弧菌占比高达75%以上，推断其可能为引发此次幼虫发病的主要致病菌。从发病幼虫的匀浆组织中分离获得该优势菌株，测序及系统发育鉴定为地中海弧菌。人工感染实验确定了其致病性，菌株US2-01在1.0×10⁶ CFU/mL的菌液浓度下浸泡感染文蛤浮游幼虫，96 h累计死亡率为84%。药敏实验表明，地中海弧菌菌株US2-01在12种抗生素的测试中对常用的青霉素、氨苄西林、红霉素等抗生素具有一定的耐药性，对四环素和多西环素中度敏感，对头孢他啶、庆大霉素、卡那霉素等其余7种抗生素呈现高度敏感。本研究首次报道了地中海弧菌为文蛤浮游期幼虫致病的一种潜在病原，研究结果可为文蛤幼虫疾病研究及贝类苗种培育过程中的病害防控提供科学依据。     

Detection of the bacterium Flavobacterium psychrophilum from a natural infection in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), using formalin-fixed, wax-embedded fish tissues

The bacterial pathogen Flavobacterium psychrophilum was successfully identified from formalin-fixed, wax-embedded tissue blocks of infected rainbow trout heart and spleen tissues, using a polymerase chain reaction (PCR)-based assay. Filamentous bacteria were observed in haematoxylin and eosin and Giemsa-stained sections but no bacteria were recovered from the diseased fish using standard bacteriology isolation techniques. All infected fish had histopathological evidence of myocarditis or rainbow trout fry syndrome. Immunohistochemistry was attempted using three different anti-F. psychrophilum sera but the results were inconclusive, and an alternative molecular approach was therefore attempted. This paper describes the use of a PCR-based assay to help identify bacteria present in formalin-fixed, wax-embedded tissue samples. This is the first time that this technique has been used for the detection of fish bacteria from diagnostic samples.     

“胃萎缩症”仿刺参幼体及亲参组织中病毒观察

海参含有丰富的蛋白质和粘多糖,营养和药用价值极高.全世界海参约有1200种,在我国海域分布的有140多种,其中以黄、渤海的仿刺参(Apostichopus japonicus)品质最佳[1].近几年,仿刺参(俗称"刺参")人工养殖已成为辽宁、山东沿海水产业重要的养殖品种之一和新的经济增长点.     

广西地区文蛤花纹的蛋白质图谱分析

利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对广西地区不同花纹文蛤外套膜的蛋白质进行了比较研究.试验结果表明,广西地区不同花纹文蛤外套膜的蛋白质图谱中多数条带相同,不同花纹文蛤间少数蛋白质的含量和种类存在差异,这些差异与文蛤花纹不同呈相关性.     

Histopathological Studies on Wild Broodstock of White Shrimp Penaeus vannamei in the Platanitos Area, Adjacent to San Blas, Nayarit, Mexico

In Mexico, the capture of wild broodstock of Penaeus vannamei or P. stylirostris for hatchery production of postlarvae is a common practice. During September 1995 and March-April 1996, high mortalities were observed in the wild broodstock captured in the Platanitos area, on the coast of San Blas, Nayarit, Mexico. As a result of these mortalities, many hatcheries closed down their facilities. Because early histological analysis had shown that some of these animals were infected with different pathological agents, such as bacteria and viruses, the present study was carried out to determine the prevalence and severity grade of infectious diseases affecting these shrimp. During March 1996, a total of 28 female and 28 male shrimp were randomly selected from a recently captured stock of 600 breeders of P. vannamei . A second sampling (28 females and 28 males) was performed from a stock of 800 breeders captured in April 1996. On this occasion, the shrimp were sampled after 10 d of acclimation in a hatchery. The animals selected for examination were those with necrosis in the cuticule, red coloration in the telson and uropods, soft cuticle, empty gut, and erratic swimming. All of the specimens were subjected to histological analysis and dot blot hybridization with a gene probe specific for Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV). The results showed that both stocks were infected with at least three different viruses (Infectious Hypodermal and Hematopoitetic Virus, Taura Syndrome Virus and Hepatopancreatic Parvo-Like Virus), gram-negative bacteria and other parasites such as gregarines. It is likely that the high mortalities observed are due to the recent introduction of TSV in the wild population of P. vannamei .