养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(Bw)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(Bw)(6.4×103cfu/ind).综合该菌在形态与生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感.WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1:1 280.免疫后第6周.免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1:3 289.6).攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组.由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击.     

迟缓爱德华氏菌病

迟缓爱德华菌病,是由迟缓爱德华菌引起鱼类、牛蛙等水生动物疾病的统称,其中鱼类疾病有肠道败血症和肝肾坏死病、鳗赤鳍病、鳗臌胀病、鳗溃疡病、鳗肝肾病、鳗肝肾综合症等。迟缓爱德华氏菌还可引起人体肠炎、腹泻、脑膜炎、蜂窝组织炎、肝脓肿、败血症等症状。为我国的三类水生动物疫病。     

牛蛙感染迟缓爱德华氏菌的研究

2001年10月底，厦门地区一些牛蛙（Rana catasbianay）养殖场养殖的牛蛙暴发流行传染病，造成大批成蛙和幼蛙死亡。经流行病学调查和病原分离鉴定，确定其主要致病原为迟缓爱德华氏野生型（Edwardsiella tarda）。该菌具有溶血性，对SPF小鼠有强致死作用，对幼蛙和蝌蚪致病力较小，根据药敏实验结果，和敏感药物进行治疗取得了良好的疗效。     

3种免疫途径下迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果

为了探讨迟缓爱德华菌菌蜕疫苗预防鳗鲡爱德华菌病的可行性,实验采用腹腔注射、口服、浸泡3种途径探讨了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果。结果表明,免疫后欧洲鳗血清抗体效价均明显升高,但菌蜕疫苗(ETG)组与福尔马林灭活疫苗(FKC)组间血清抗体效价无显著性差异。欧洲鳗注射、口服、浸泡ETG组的相对免疫保护率分别为75.0%、52.5%、37.5%,分别高于FKC组的55.0%、40.0%、32.5%,且ETG组欧洲鳗死亡时间明显推后,表明菌蜕疫苗的免疫保护效果优于福尔马林灭活疫苗。易操作、对鱼体应激少的ETG疫苗口服免疫欧洲鳗获得了52.5%的免疫保护率,在预防鳗鲡爱德华菌病中具有良好的应用前景。     

迟钝爱德华氏菌感染大菱鲆的病理学研究

采用光学显微镜和电子显微镜技术分别对患迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)病的大菱鲆(Scophthalmus maximus)的病理学变化进行了研究.结果发现,迟钝爱德华氏菌可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、心脏、肠和鳃等多个器官组织发生不同程度的病变,其中以肾脏病理变化最为显著,主要表现为造血组织局部坏死、单核巨噬细胞显著增生和肉芽肿形成.肝脏发生脂肪变性,血窦扩张充满单核巨噬细胞,严重者发生局部坏死;脾脏单核巨噬细胞增生显著,脾实质出现多处局部坏死;心肌纤维变性,肌纤维间有单核巨噬细胞浸润,病变严重者形成局部坏死灶.此外,在病鱼的肠和鳃内也发现大量单核巨噬细胞浸润的现象.研究表明,迟钝爱德华氏菌感染的大菱鲆主要是以单核巨噬细胞来参与炎症反应.爱德华氏菌病的病理分型应属肾脏型或肝肾混合型.     

罗非鱼迟缓爱德华氏菌病的分离鉴定

从广西某鱼场的发病罗非鱼(Tilapia nilotica)中分离到1株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,在普通琼脂平板上生长,菌落圆形,边缘整齐,灰白色,湿润菌落,直径为0.5～1.0 mm,有动力,接触酶阳性,赖氨酸及鸟氨酸脱梭酶阳性,还原硝酸盐为亚硝酸盐,发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,经细菌形态、培养特征、生化特性测定结果均符合迟缓爱德华氏菌的特征.应用PCR技术扩增出576 bp目的片段,通过PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对结果,进一步确定为迟缓爱德华氏菌.致病性试验结果显示分离菌株具有致病性,对氧氟沙星、氯霉素、氟哌酸、恩诺沙星、先锋霉素等高度敏感.     

养殖大菱鲆爱德华氏菌病的研究

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。 关键词：大菱鲆;迟钝爱德华氏菌;细菌鉴定;组织病理学;16S rDNA     

养殖大菱鲆的爱德华氏菌病

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。     

柱状噬胞菌与迟缓爱德华氏菌混合感染鳗鱼报告

1995年3月至1997年2月，我们多次从病鳗的鳃、肝、肾、腹水病料中同时检出柱状噬胞菌和迟缓爱德华氏菌，对其生物学特性和病原学进行了初步研究，现报告如下：1病鳗症状初期鳗鱼摄食下降，傍晚和夜间在水面上无力逆游晃动或紧贴池壁或挂在食台上，反应迟钝，2天后每池有死鳗20余尾。捞起病鳗只见腹部各处皮肤出血，一片潮红，肝区肿大，鳍充血，严重的前腹部穿孔。解剖见鳃上粘液很多，鳃丝肿胀，呈暗红色或灰白色，鳃片缺损，有的只剩下鳃柄，指压鳃部有血水流出，肝脏、肾脏肿大，有脓疡病灶，胃内多有积水，有的腹水达20ml。2病原菌分离…     

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构, 可诱导机体的体液和细胞免疫应答, 成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性, 实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体, 转化迟缓爱德华氏菌, 成功制备其菌蜕, 并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明, 细菌菌蜕表面形成溶菌孔道, 细胞因内容物流失而发生明显的皱缩; 构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解, 5 h后裂解基本完成, 裂解效率为99.99%, 冷冻干燥后重悬涂布平板, 未检出活菌, 电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化; 构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD₆₀₀值为0.4和0.6进行诱导, 其裂解过程和裂解效率没有明显区别; 分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究, 其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全, 是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕, 并对其制备条件进行了优化, 为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。     

Pathology of Edwardsiella tarda infection in turbot, Scophthalmus maximus (L.)

Macroscopic and histopathological changes in cultured turbot, Scophthalmus maximus (L.), in Spain caused by infection with Edwardsiella tarda are described. Eye tumefaction, inflammation, haemorrhages, ascites and the presence of a purulent fluid were the main macroscopic lesions observed. Histopathological lesions were found in the kidney, spleen and liver. In the kidney and spleen these were characterized by a severe apostematous inflammatory reaction, with a large number of abscesses. The liver was affected to a lesser degree and only some phagocytes loaded with bacteria were observed. Ultrastructural observations indicated that macrophages were the main cell type implicated in the inflammatory response. Most of the bacteria observed within the phagocyte cytoplasm showed no degenerative changes and some were dividing. Degenerative changes observed in macrophages indicate their failure in preventing the infection.     

Edwardsiellosis in farmed turbot,Scophthalmus maximus (L.), associated with an unusual variant of Edwardsiella tarda: a clinical,aetiological and histopathological study

During 2005 and 2010, a survey of edwardsiellosis on eight turbot, Scophthalmus maximus (L.), farms was conducted in China. This report presents the detailed results of the study on this disease. Diseased turbot displayed two distinct types of gross signs: black discoloration of the dorsal skin on the posterior portion of the body; and red cutaneous foci on the ventral side. Internally, the most pronounced clinical signs in all fish examined were enlarged kidneys. The causal agent of the disease was finally proved to be one species of bacterium that was identified as Edwardsiella tarda by physiological and biochemical tests, API 32E and 16S ribosomal RNA sequence analysis. It is noteworthy that unlike the commonly described E. tarda strains, the isolates in this study were non‐motile strains without flagella. A histopathological study revealed that E. tarda infection was systemic in turbot and that kidney showed the most significant pathological changes, including acute focal necrosis, an influx of macrophages and formation of granuloma. The most common histopathological characteristics of this disease are the proliferation of macrophage in various organs and formation of granuloma. In addition, this article also gave background information on the disease and presented the results of virulence tests with the E. tarda strain identified in this study.     

Characterization of Edwardsiella tarda strains isolated from turbot, Psetta maxima (L.)

The biochemical, serological and molecular characteristics of a group of 21 Edwardsiella tarda strains isolated from turbot, Psetta maxima, in two different areas of Europe were analysed and compared with a total of 13 strains of this bacterial species with different geographical and host origins. All the turbot isolates were biochemically identical to the E. tarda strains included as reference. The use of different techniques including microagglutination, dot blot and Western blot of lipopolysaccharides allowed us to determine that all the turbot isolates constitute an homogeneous and distinctive serological group. Genetic analysis by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis demonstrated that although the E. tarda strains from turbot were compiled in a unique group using the primers P3 and P6, two clonal lineages could be detected when oligonucleotides P4 and P5 were employed.     

纯氧充气对大菱鲆生长及水质指标的影响

主要研究了纯氧增氧技术对大菱鲆的生长及养殖水体中几项重要水质因子的影响。本实验中,实验池中的溶氧最低能维持在8.96±0.16mg/L,最高时可达到12.2±0.71mg/L。经过282d的培养,大菱鲆体重由30.43±0.42g达到1103.73±19.00g,日增重率平均为1.24±0.14%,整个实验期间大菱鲆均处于快速生长状态。至实验结束时,养殖密度最终达到33.99±0.59kg/m3。养殖水体中,pH变化范围在7.62～8.03之间,平均pH为7.76±0.05。COD变化范围在0.75～1.85mg/L,平均COD为1.04±0.16mg/L。亚硝酸盐浓度1.27～7.23μg/L之间,平均浓度在3.23±0.21μg/L。氨氮浓度一般维持在0.07～0.28mg/L,平均浓度为0.14±0.02mg/L。硝酸盐浓度在0.39～0.69mg/L之间,平均浓度为0.51±0.02mg/L。COD、pH、亚硝酸盐浓度很低,均在渔业水质标准所规定的范围以内。     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。     

牙鲆迟钝爱德华氏菌血清型及荧光抗体检验

以迟钝爱德华氏菌的代表菌株(HC010907-1)为免疫原,制备免疫血清,对分离于牙鲆鱼的130株迟钝爱德华氏菌进行了血清型检定,结果表明:供试的130株迟钝爱德华氏菌均为同种血清型;同时以此免疫血清为第一抗体,以标准羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,进行了荧光抗体技术检验迟钝爱德华氏菌的可行性试验,表明亦具有较强的特异性。