应用Dot—ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ快速检测草鱼出血病病毒的方法以及提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。     

应用Dot_ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）快速检测草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。结果表明，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＧＣＨＶ的最低含量为３ｐｇ，该灵敏度比ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法分别提高１０倍和２０倍，而且快速易行，是目前检测ＧＣＨＶ最为有效的方法，并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。     

草鱼出血病及其防治对策

随着草鱼养殖密度的加大，养殖的集约化及养殖产量的提升，其病害日趋严重。据调查，草鱼的养殖成活率在５０％左右。危害草鱼的病害种类较多，尤以草鱼出血病危害最为严重。该病流行范围广，传染速度快，死亡率高，防治难度大，每年给渔业生产带来严重威胁和巨大的经济损失。１病原体草鱼出血病的病原体为呼肠弧病毒。该病毒为双链RNA类型病毒。该病毒颗粒直径在６５～７０纳米之间。具二十面体，无夹膜，双层衣壳，对脂溶剂、热、酸均不敏感。该病毒能在草鱼吻端、性腺、肾脏鳍条等草鱼单层细胞中复制。２流行与危害草鱼出血病是目前危…     

草鱼出血病病原—鱼呼肠孤病毒(FRV)核酸特性的研究

<正> 本协作组曾报道从草鱼出血病病鱼组织中首次分离出一种直径约为60nm的球形病毒,并证实这一病毒为草鱼出血病的病原。随后,做了其精细结构的观察与分析。本文对该病毒的核酸基本特性进行了研究。根据我们以前和本文报道的     

草鱼出血病鱼主要器官组织的超薄切片观察及感染力的比较

草鱼出血病是一种严重的病毒性疾病,它会引起草鱼大批死亡。已有报告指出,在病鱼肾组织的超薄切片中观察到病毒粒子的存在,并认为肾脏是草鱼出血病病毒侵袭是严重的器官。在制备草鱼出血病组织疫苗时仅取病鱼的肝、脾、肾和肌肉组织,肠道组织往往弃之不用。为了进一步确定病     

全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。     

草鱼吻端组织细胞株ZC—7901培养草鱼出血病病毒的研究初报

<正> 草鱼出血病是我国淡水渔业中危害最严重的鱼病之一。国内鱼病工作者从七十年代初开始对该病进行研究,已证实该病的病原是病毒。利用可长期离体传代培养和生物学特性稳定而均一的鱼类细胞株培养病毒,是鱼类病毒学研究的重要手段,将有助于对病原和防治技术作深入的研究。我们于1979年培养成功草鱼吻端组织细胞株ZC—7901(以下简称ZC—7901)。经试验,该株细胞对草鱼出血病病毒具有敏感性。本文报道ZC—7901株细胞培养草鱼出血病病毒的初步结果。     

对虾的主要疾病及其诊断方法

诊断对虾病原的方法有传统的形态病理学（光镜和电镜直接观察和组织病理学等）、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法，对皮下及造血组织坏死病毒病（IHHNV）、肝胰脏细小病毒病（HPV）、拖拉症（Taura syndrome,TS）、白斑综合症（WSSV）、斑节对虾型杆状病毒病（MBV）和杆状对虾病毒病（BP）等病原均采用非放射性的基因组探针目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子虫的传统基因探针，根据聚合酶链式反应（PCR），采用DNA扩增方法确立的检测某些病原的高敏感性方法也应用在对虾病原诊断上。     

PCR技术在对虾病毒病检测上的应用及研究进展

聚合酶链式反应PCR具有特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好等优点,多种临床样品均可用PCR进行检测,现已开发出多种PCR新技术,用于生物学科的各个领域。本文对PCR技术的原理及其在动物疫病尤其是对虾病毒病的检测中的应用及研究进展做一综述,以期对对虾病毒病的诊断与防治有所帮助。     

Rapid detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV), the pathogenic agents of white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (De Man), by loop-mediated isothermal amplification

A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) procedure is described for rapid diagnosis of white tail disease, a viral disease caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV), in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. This method was more sensitive than conventional RT-PCR for detecting the two viruses. A set of four primers, two outer and two inner, were designed for MrNV detection. An additional pair of loop primers was also used in an accelerated LAMP reaction for detection of XSV. Time and temperature conditions were optimized for detection of the two viruses. The LAMP reaction is highly suited for disease diagnosis in developing countries as amplification of DNA can be detected without the use of agarose gel electrophoresis, by the production of whitish precipitate of magnesium pyrophosphate as a by-product.     

Design and validation of a RT‐qPCR procedure for diagnosis and quantification of most types of infectious pancreatic necrosis virus using a single pair of degenerated primers

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) is an important virus which affects the salmonid aquaculture industry worldwide; therefore, it is important to develop rapid and reliable methods of diagnosis to detect the disease at early stages. Nowadays, RT‐qPCR is replacing other methods because it provides additional information on the viral load, which is important to have a better understanding of the virus replication level and of the stage of the infection and its risk level. The main problem stems from the high diversity of this virus, which can compromise the reliability of the diagnosis. In this study, we have designed an RT‐qPCR procedure for diagnosis and quantification of IPNV based on a single pair of primers targeted to segment B. The procedure has been validated, in vitro and in vivo, testing two different types of standards against seven reference strains and 23 field isolates from different types. The procedure is reliable for the detection of any type, with a detection limit of 31 TCID₅₀ mL^?1, 50 pfu mL^?1 or 66 RNA copies mL^?1, depending on the standard. All the standard curves showed high reliability (R² > 0.95). The results support the high reliability of this new procedure for the diagnosis and quantification of IPNV.     

鲤春病毒血症病毒核蛋白、磷蛋白与基质蛋白的表达、抗体制备及免疫原性比较

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异性进行分析验证。结果发现,SVCV的N、P和M重组蛋白均在原核表达系统获得大量表达,且表达的蛋白经纯化后免疫实验动物产生了相应的多克隆抗体。Western blot结果显示,3种蛋白抗体均与SVCV重组蛋白及天然蛋白发生特异性的免疫反应。ELISA结果显示,针对P蛋白制备的抗体效价最高,可达409 600;针对N和M蛋白制备的抗体效价也均大于204 800。同时,特异性检测实验结果显示,制备的3种蛋白抗体均仅与SVCV发生特异性免疫反应,而与SVCV宿主其他易感病毒均不发生交叉反应。实验结果将对SVCV的快速诊断及疫苗开发提供新的手段和思路。     

白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明,LAMP方法适合对虾白斑综合征病毒的现场快速检测。     

Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens

Fish and shellfish diseases are a constant threat to the sustainability and economic viability of aquaculture. Early diagnosis plays a vital role in management of fish and shellfish diseases. Traditionally, various biochemical and serological tests have been used for fish disease diagnosis. However, the time and expertise required for such diagnoses makes it difficult for aquaculturists to easily adopt them under production conditions. Polymerase chain reaction and probe-based nucleic acid detection have become increasingly popular in fish and shellfish diagnostics. Recently, a novel technique called loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed, which is highly sensitive and rapid. LAMP has been used for the detection of bacterial, viral, fungal and parasitic diseases in both animal and plants. In aquaculture, LAMP-based detection of pathogens like Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Nocardia seriolae, Tetracapsuloides bryosalmonae, white spot syndrome virus and infectious haematopoietic necrosis virus have been reported. In this review, the application of LAMP for the detection of aquaculture-associated pathogens is discussed.