淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。为了明确淇河鲫MSTN基因序列及其在肌肉生长发育中的调控功能,本研究利用RACE方法克隆淇河鲫MSTN全长c DNA序列,q RT-PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。结果显示,淇河鲫MSTN c DNA序列全长2094 bp(no.KC851952.1),包含86 bp 5′非编码区、880 bp 3′非编码区和1128 bp开放阅读框,编码375个氨基酸残基,前22个氨基酸残基为信号肽,34~256位氨基酸残基为TGF-β前肽域,281~375是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RIRR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。蛋白同源分析发现淇河鲫MSTN与鲤形目鱼类相似性较高,与哺乳动物和鸟类的相似性最低。系统进化分析显示,淇河鲫MSTN与鲫、鲤、鳡等鲤科鱼类亲缘关系较近。实时定量PCR分析表明,淇河鲫MSTN基因在各个组织中均有表达,脑中表达量最高,其次为肌肉和肝脏,肠道表达量最低。淇河鲫胚胎发育的各阶段MSTN基因均有表达,受精卵表达量最高,其次为囊胚期,神经胚期表达量最低。推测MSTN与淇河鲫肌肉发育生长具有一定的相关性,可能参与"双背鲫"特征的形成。     

淇河鲫R-spondin1基因cDNA克隆和表达

为探索R-spondin1(Rspo1)基因在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,本研究利用RACE技术克隆Rspo1基因cDNA序列,同时分析它的时空表达模式,并检测芳香化酶抑制剂Letrozole及高温养殖诱导性逆转下它在性腺中的表达情况。将扩增的PCR产物经亚克隆测序、拼接后获得淇河鲫Rspo1 cDNA序列,长1 243 bp(MH243761),包含5′非编码区318 bp,3′非编码区127 bp和开放读码框798 bp,共编码265个氨基酸残基。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Rspo1与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性相对较低;组织分布检测结果显示,Rspo1基因在淇河鲫各个组织中均有表达,其中肌肉组织表达量最高,卵巢次之,而在脾脏、肾脏、心脏组织中表达量较低;在胚胎发育过程中Rspo1的表达量在未受精卵与受精卵中无差异,随着胚胎发育而降低,神经胚期最低,从尾芽期至出膜期又逐步升高。胚后阶段,Rspo1在性腺中的表达量从淇河鲫性别决定与分化关键时期(孵化后20 d)开始上调。Letrozole处理或高温养殖引起的性逆转中,Rspo1在性腺中表达量升高。研究表明,淇河鲫Rspo1作为一个母源性因子可能在卵巢分化与维持中起到一定作用,同时它可能也参与精子发生过程。     

淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,M n S A A基因c D N A全长649 b p(G e n B a n k登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12~72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12~72 h和6~72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。     

团头鲂Toll样受体Ⅱ基因的克隆与表达分析

为了研究团头鲂(Megalobrama amblycephala)TLR2(ma TLR2)在抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染中的作用,本实验克隆了ma TLR2基因的c DNA全长。结果显示:ma TLR2基因c DNA的全长包括2923 bp,编码792个氨基酸。预测得到的ma TLR2的结构域包括一个信号肽、氨基端的亮氨酸重复基序(LRRs)、跨膜结构域(TM)和一个胞内的Toll/白介素(IL)-1受体区(TIR)。在嗜水气单胞菌感染后,团头鲂头肾中,TLR2的表达量在6 h时显著升高。TLR2下游相关的炎症细胞因子TNF-α的表达量也显著上调。结果表明ma TLR2在嗜水气单胞菌感染团头鲂后的免疫应答中起到了重要作用。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

淇河鲫IL-8 cDNA克隆及组织表达分析

IL-8是最早发现的趋化因子,属于CXC亚家族,与鱼类非特异性免疫水平关系密切。实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,从淇河鲫总RNA反转录产物中获得了641 bp IL-8cDNA序列,其中包含102 bp的5’非编码区,242 bp的3’非编码区和297 bp的开放阅读框。该基因编码由98个氨基酸残基组成的前体蛋白,前22个氨基酸残基为信号肽。肽链中含有4个保守半胱氨酸,前2个半胱氨酸被1个精氨酸分隔,形成CXC结构。第一个半胱氨酸前缺乏ELR基序,其组成是DPR。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,淇河鲫IL-8与鲤、鳙、草鱼、鲢等鲤科鱼类的进化关系较近,与鲤IL-8的同源性最高(94%)。通过实时荧光定量PCR检测,淇河鲫IL-8在被检测的8个组织中都有表达,其中在肌肉中的表达量最高,其次为脾脏、头肾和脑等。研究结果对调控淇河鲫非特异性免疫能力,提高淇河鲫健康养殖水平具有一定参考价值。     

梭鲈ghrh基因序列特征及其在大小个体间差异表达分析

为了探究生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone,ghrh)基因对梭鲈(Sander lucioperca)生长调控的作用,本研究利用RACE技术克隆获得了ghrh cDNA基因全长序列,并利用实时荧光定量PCR技术对其组织表达模式和大小个体间表达模式进行了分析。结果显示：ghrh基因cDNA全长为1 100 bp,包含494 bp的5′非编码区、180 bp的3′非编码区和编码141个氨基酸的开放阅读框。氨基酸多重比对发现,梭鲈ghrh与河鲈(Perca fluviatilis)、黄金鲈(P.flavescens)的ghrh氨基酸序列相似性分别为95.04%和94.33%,ghrh基因在鱼类和哺乳动物中都存在一个GLUCA保守结构域(65～91 aa)。ghrh基因在梭鲈各组织均有表达,脑组织中相对表达量最高,垂体次之,与其他组织相比差异显著。ghrh基因表达量与梭鲈体质量呈正相关,脑、肝和肌肉组织中ghrh基因表达量均为体质量极大组高于极小组,其中,脑组织中差异显著。因此,ghrh基因可以作为梭鲈生长候选基因用于分子选择育种。     

黄芪多糖对淇河鲫生长性能、抗氧化功能及抗病力的影响

将淇河鲫(Carassius auratus)随机分为 4 组, 分别以普通饲料、黄芪多糖添加量为 500 mg/kg、1000 mg/kg、 1500 mg/kg 的饲料进行投喂, 42 d 后检测其生长性能、脏器指数和肝脏抗氧化酶活性(总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后淇河鲫的存活率。实验结果显示, 不同剂量的黄芪多糖可显著(P＜0.05)增加淇河鲫增重率和特定生长率; 黄芪多糖添加后淇河鲫肾脏指数和脾脏指数无变化, 仅 1000 mg/kg 黄芪多糖添加组肝脏指数显著高于对照组(P＜0.05); 黄芪多糖能显著增加淇河鲫肝脏 SOD、 CAT 和 GPx 活性, 降低肝脏 MDA 含量(P＜0.05); 不同剂量黄芪多糖添加后均可提高淇河鲫在嗜水气单胞菌攻毒后的存活率, 且 1000 mg/kg 添加组抗菌效果最好, 96 h 后淇河鲫存活率为 75%。上述结果表明, 黄芪多糖可促进淇河鲫生长, 增强其抗氧化能力, 从而提高其抵御细菌感染的抗病力。综合分析和评估, 在水产养殖淇河鲫幼鱼饲料中黄芪多糖适宜添加量为 1000 mg/kg, 可有效防控鱼类感染嗜水气单胞菌疾病的发生。     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

大口黑鲈leptin A基因的组织表达及其对急性低氧胁迫的响应

瘦素(leptin)是一种重要的激素,参与调节动物的摄食、繁殖和能量消耗,其可以通过抑制食欲和促进能量代谢的方式维持机体能量稳态。大多数鱼类具有双重瘦素基因。在本研究中,利用PCR技术克隆了大口黑鲈leptin A基因的编码区,其开放阅读框(ORF)为486 bp,编码161个氨基酸蛋白。通过与其他物种进行同源性比对,发现鲈形目的 leptin基因的保守性较高,一致性高达91.46%,在大口黑鲈leptin A中几乎不存在基因特异性突变位点,而且大口黑鲈leptin A氨基酸序列与鳜同源性最高(92.59%),与花鲈(89.51%)、布氏鲳鲹(87.04%)、斜带石斑鱼(83.87%)的同源性次之。组织分布结果显示,leptin A基因在肝脏中的表达量最高,在心脏、头肾、脑、中肾、肠、脾脏、鳃、肌肉和性腺中的表达量均较低。此外,对大口黑鲈进行不同程度急性低氧胁迫[重度低氧(1.2±0.2)mg/L和中度低氧(3.5±0.2)mg/L],发现低氧胁迫初期时,严重低氧组和中度低氧组的leptin A的表达量都升高,显著高于对照组Leptin A的表达。这表明急性低氧能够诱导大口黑鲈leptin A在肝脏中的表达。综上所述,大口黑鲈leptin A基因与鳜leptin A基因的同源性最高,leptin A主要在大口黑鲈肝脏中显著表达,急性低氧胁迫能显著诱导leptin A的表达。     

中国大鲵Sox19 基因全长cDNA 序列的克隆及组织表达分析

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了中国大鲵(Andrias davidianus)Sox19基因全长cDNA序列,并进行各组织间的表达分析。中国大鲵Sox19基因全长1290 bp,ORF长858 bp,编码285个氨基酸,位于39~109位的HMG-box是其主要功能区。氨基酸序列分析表明,其与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)及红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度分别为64%、58%、55%。采用邻接法对不同物种的Sox19编码区序列构建分子系统树发现:中国大鲵Sox19基因属于较早从鱼类分化出来的基因,表明Sox19基因从中国大鲵到鱼类的进化速度比较快。荧光定量PCR结果显示,Sox19在所有检测的组织中均有表达,且在心脏中的表达量最高,卵巢中次之,肾脏中的表达量略高于肠道。中国大鲵Sox19基因的发现打破了Sox19基因一直被认为是鱼类所特有基因的观点,填补了两栖类有关此基因的空白,为更进一步的了解Sox19基因在中国大鲵中的重要功能奠定了基础,同时Sox19基因还可作为研究中国大鲵早期胚胎神经系统发育情况的分子标记,为其他两栖类动物的研究提供借鉴。     

利用cDNA-AFLP技术研究副溶血弧菌感染下拟穴青蟹的基因差异表达

研究以实验室分离自汕头牛田洋青蟹养殖区的副溶血弧菌感染的健康拟穴青蟹,利用cDNA-AFLP技术分析感染前后拟穴青蟹肝脏组织基因的转录表达差异,最终获得了23个差异片段,其中20个片段成功测序。BLAST分析表明,序列与已知功能基因具有同源性的有6个,其中5个经real-time PCR重新验证为上调表达,主要涉及参与能量代谢的精氨酸激酶(arginine kinase)和甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase),以及参与转运过程的精氨酰tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase),同时,还有直接参与免疫防御反应的凝乳状蛋白酶(chymotrypsin-like proteinase)。另外,8个差异片段与已知基因或序列无同源性。     

山瑞鳖细菌性败血症病原菌的分离鉴定及其毒力基因检测

查明广西南宁、贵港和桂平养殖山瑞鳖细菌性败血症的病原菌及其6种毒力基因的携带情况,为有效防控山瑞鳖细菌性败血症提供参考。本研究以常规方法从患病山瑞鳖的心脏和肝脏取样、分离细菌,人工感染方法确定分离菌株的致病性,细菌鉴定采用API 20NE生化鉴定和16S rRNA分子鉴定相结合的方法进行,PCR扩增法对菌株的溶血素基因(hemolysin gene,hly)、气溶素基因(aerolysin gene,Aer)、细胞兴奋性肠毒素基因(cytotonic enterotoxin gene,Alt)、细胞毒性肠毒素基因(cytotoxic enterotoxin gene,Act)、黏附素基因(major adhesin gene,ahal)和丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene,ahp)6种毒力基因进行检测。结果显示,从患病山瑞鳖心脏和肝脏中共分离到4株优势菌SRB125、SRB142、SRB143和SRB345,对健康山瑞鳖的平均致死率为97.50%~100.00%,是引起山瑞鳖细菌性败血症的病原菌;生化和分子鉴定结果显示,4株分离菌均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与A.hydrophila L3-5(KP716701)菌株的亲缘关系最近,同源相似性均达到99.9%;6种毒力基因共包含2种毒力基因型,在4株菌株中的分布为hly~+Aer~+Alt~+Act~+ahal~+ahp~+和hly~+Aer~+Alt~+Act~+ahal~+ahp~–各2株,来源于南宁的SRB143和桂平的SRB345菌株均缺失ahp基因。     

近江蛏精子超微形态结构观察及与缢蛏精子的比较

利用扫描电镜和透射电镜分别观察了近江蛏和缢蛏成熟精子的超微形态结构。发现近江蛏精子与缢蛏精子在超微形态结构上差异很大。近江蛏精子为典型的原生型,成熟精子由头部、中段和尾部组成,头部包括顶体和细胞核。近江蛏精子与缢蛏精子顶体均为保龄球状,但近江蛏精子顶体全长比缢蛏短。近江蛏精子细胞核略扁圆形,外缘具8～9个圆弧形凸起；缢蛏精子细胞核则呈圆球状。近江蛏精子中段由线粒体和中心粒复合体构成,线粒体一般5个,个别4～6个；缢蛏线粒体5个或6个。近江蛏精子尾部为细长的鞭毛,轴丝为“9 2”结构,与缢蛏的相同。从近江蛏与缢蛏的精子形态差异看,两者应属于种间差异。     

栉孔扇贝Dmrt1的分子鉴定及表达模式分析

DMRT1是DMRT家族重要成员之一，主要参与动物性别决定和分化调控，但在不同动物中其表达和功能调控作用存在差异。本研究采用生物信息学方法分析了栉孔扇贝（Chlamys farreri）Dmrt1的序列特征，采用半定量RT-PCR技术确定了其mRNA在成体性腺、闭壳肌、外套膜、鳃和肾等组织中的分布，定量RT-PCR和原位杂交技术揭示了Dmrt1 mRNA在性腺中的时空表达特征。结果显示：栉孔扇贝Dmrt1序列中含有DMRT家族保守的DM结构域；其mRNA仅在栉孔扇贝性腺中表达，在精巢中的表达明显高于卵巢，并且以生长期精巢的表达水平最高；原位杂交检测Dmrt1阳性信号主要定位于生殖细胞的细胞质中。研究结果表明，Dmrt1在栉孔扇贝性腺中的表达特征与大部分动物性腺中的表达特征基本一致，推测其可能参与性别分化和精巢发育的功能调节。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。