红螯螯虾血细胞分类、结构与免疫特性研究

血细胞在甲壳动物免疫过程中起重要作用,探讨红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)不同类型血细胞结构与免疫特性有助于其病害防治。应用流式细胞术(FCM),根据前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)的强度差异对血细胞进行分类,利用特异性荧光染料进行标记,分析血细胞总数(THC)、线粒体数量、溶酶体数量、吞噬活力、活性氧(ROS)含量、一氧化氮(NO)含量和非特异性酯酶活力。结果显示,应用FCM可以区分透明细胞(HC)、半颗粒细胞(SGC)和颗粒细胞(GC)三类血细胞,其占比分别为9.82%、61.11%和25.24%;红螯螯虾平均血细胞总数(THC)为(8.43±0.87)×10~6个/mL;GC含有最多数量的线粒体和溶酶体,HC中含量最少;HC、SGC和GC的吞噬率分别为2.54%、14.45%和6.98%,SGC吞噬活力最强,HC最弱;HC、SGC和GC的活性氧(ROS)含量分别为7.80、45.95和134.69 AU,GC的ROS含量最高,HC最低;HC、SGC和GC的一氧化氮(NO)含量分别为8.20、79.78和344.31 AU,GC的NO含量最高,HC最低;HC、SGC和GC的非特异性酯酶活力分别为86.59、121.84和236.91AU,GC的酯酶活力最高,HC最低。研究表明,红螯螯虾三类血细胞在形态结构、数量及免疫特性上均存在差异,SGC的数量最多、吞噬活力最强,而GC含有最多与能量供应、免疫防御相关的细胞器,并拥有最强的氧化活力和酯酶活力,表明GC和SGC是红螯螯虾免疫防御过程中发挥主要作用的血细胞类型。     

流式细胞术与显微观察对罗氏沼虾血细胞的比较研究

应用流式细胞术和显微观察对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）血细胞的分类分群和各类细胞组成比例进行研究，比较2种方法的优缺点。应用显微观察，根据细胞颗粒的有无和大小以及细胞染色情况，可把罗氏沼虾血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。根据其血细胞的前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）特性的不同，也将血细胞分为3个亚群：透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。检测各种细胞所占的比例，2种方法测得比例均为：小颗粒细胞〉大颗粒细胞〉透明细胞；2方法的结果存在显著差异（P〈0．05），但相关性极显著（P〈0．01）。利用流式细胞术可更快捷、准确，减少人为误差，显微观察可对细胞内部结构进行更深入的分析，并可进行细胞实际大小和细胞密度的测定。2种方法互补不足，可更快速、准确、全面地进行细胞基础特征的研究。     

流式细胞术在克氏原螯虾血细胞的分类、活性和免疫功能研究中的应用

应用流式细胞术(FCM)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血细胞的分类、活性和免疫功能进行了研究。结果显示:血细胞可分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞三个亚群,组成比例分别为(26.25±5.29)%、(51.44±7.02)%和(11.20±1.82)%;螯虾血细胞的平均总凋亡率约为3.12%;血细胞对荧光大肠杆菌的吞噬活力显著(P<0.05)高于荧光微球,吞噬率分别为17.04%和14.57%;血细胞在自然生理状态下含有一定量的活性氧,其在两类颗粒细胞的含量显著(P<0.05)高于透明细胞,在大颗粒细胞中最高。结果表明,FCM能较好地应用于虾类的血细胞分类和功能研究。     

泥蚶血细胞的形态结构特征及部分免疫功能

利用光镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪技术对泥蚶血细胞形态结构以及吞噬活性进行了研究。根据细胞大小、形态结构、颗粒特点,光镜下可将血细胞区分为红色颗粒细胞(占89.67%)、嗜碱性颗粒细胞(占7.05%)、透明细胞(占3.28%)3种主要类型。健康泥蚶血淋巴中血细胞平均密度为(3.29±0.82)×10⁶ /mL。透射电镜下观察到颗粒细胞Ⅰ型、颗粒细胞Ⅱ型、无颗粒细胞;扫描电镜观察下,细胞表面光滑,部分细胞表面有小的突起物。用流式细胞仪检测出P1(13.13%)亚群和P2(78.83%)两个细胞亚群以及没有固定形态的细胞(近8%)。利用APIZYM 试剂盒对健康泥蚶血细胞及血清中的19种酶进行检测,在血细胞中检测到11种酶,在血清中检测到了13种酶,经酵母聚糖刺激后,碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、类脂脂酶、N-乙酰葡萄糖胺酶在血细胞和血清中的水平大幅升高。体外吞噬实验观察显示,红色颗粒细胞对酵母聚糖具有明显的吞噬能力,嗜碱性颗粒细胞和透明细胞吞噬作用不显著;在经嗜水气单胞杆菌刺激后,嗜碱性颗粒细胞出现大量聚集现象,透明细胞能吸附颗粒物。吞噬活性研究表明,温度、盐度对泥蚶血细胞的吞噬活性有显著的影响,在泥蚶适宜生长温度(13~30 ℃)区间和最适盐度(20.0~26.2)×10^-12区间,血细胞吞噬活性达到最高值。     

橄榄蛏蚌血细胞形态及吞噬能力的初步研究

对橄榄蛏蚌(Solenaia oleivora)血细胞的形态特征和吞噬作用进行了初步研究。基于瑞氏染色后血细胞的形态、颜色、大小等特征,可将橄榄蛏蚌的血细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞、类淋巴细胞共4种类型。透明细胞的直径最大,小颗粒细胞次之,类淋巴细胞最小;透明细胞的胞核直径最大,小颗粒细胞次之,大颗粒细胞最小。类淋巴细胞的核质比最大(0.67),其他3种细胞的核质比为0.37～0.48。4种血细胞所占比例以小颗粒细胞最高(43.6%),透明细胞次之(36.6%),类淋巴细胞最低(7.0%)。橄榄蛏蚌平均血细胞浓度为(4.21±1.51)×105个/mL,个体的血细胞浓度与体重(或壳长)不相关(P>0.05),不同体重组(或壳长组)的平均血细胞浓度无显著差异(P>0.05)。在37℃体外吞噬试验中,橄榄蛏蚌血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬比例为(43.6±7.0)%,吞噬指数为(0.743±0.145)。4种血细胞中,小颗粒细胞的吞噬比例最大(0.288±0.061),类淋巴细胞不具吞噬能力。     

流式细胞术比较研究三种对虾血细胞的分群

应用流式细胞术对墨吉对虾(Penaeus merguiensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)三种对虾的血细胞类型进行了比较研究。根据其血细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特征的不同将血细胞分群,FSC和SSC二维图分析表明三种对虾的血细胞都可分为三个亚群:透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞。同时还对各种类型血细胞所占比例进行了比较研究,发现各个亚群血细胞所占组成比例在三种对虾之间具有相似性。其比例均为:小颗粒细胞最多,约为45%~49%;透明细胞次之,约为26%~28%;大颗粒细胞最少,约为10%~12%。     

日本(虫寻)血淋巴细胞的初步研究

对日本(虫寻)血淋巴细胞有形成分进行显微观察分析,根据细胞大小、有无颗粒及颗粒的大小进行分类.结果表明日本(虫寻)血淋巴细胞可区分为3种,即大颗粒细胞、小颗粒细胞和无颗粒细胞.在此基础上比较了不同性别、不同发育阶段及饥饿状态下,日本(虫寻)血淋巴细胞的形态、密度及3种类型细胞所占比例等指标的数据变化,并与其他甲壳动物的血细胞进行了比较.     

河北3个日本沼虾野生群体线粒体DNAD-Loop基因序列变异及种群遗传结构分析

为进一步了解白洋淀与衡水湖日本沼虾种质资源现状,实验通过对白洋淀南淀(SB)、白洋淀北淀(NB)、衡水湖(HS)日本沼虾群体线粒体DNA D-Loop基因片段进行扩增和测定,得到935 bp的序列用于进一步的分析,其中变异位点80个,占分析位点的8.56%,含有77个简约信息位点,平均转颠换比值(TS/TV)为7.28,4种碱基在所得序列中平均含量为A(42.65%)、G(9.08%)、T(36.98%)、C(11.29%),其中A+T含量为79.63%,明显高于C+G含量。AMOVA分析结果显示,群体间的遗传分化系数FST=0.2336,群体间遗传变异占23.36%,群体内遗传变异占76.64%,群体间具有较高程度的遗传分化。运用K-2-P模型构建了3群体的23个单倍型的NJ系统发育树,单倍型之间并没有按照单倍型所属群体的分类聚簇,表现为不同群体个体相互交错形成复杂的簇群。群体中性检验、错配分析表明,日本沼虾近期未曾经历过种群扩张。     

克氏原螯虾血细胞及免疫功能的初步研究

甲壳动物血细胞在宿主免疫应答中发挥着重要的作用，其中包括识别、吞噬、包囊黑色素形成、胞毒作用和胞间的信息传递。不同类型的血细胞其防御机制不同，因此血细胞的形态和分类是甲壳动物免疫学的基础。通常情况，十足目甲壳动物的血细胞类型主要依据细胞质中颗粒物质的有无和颗粒物质的相对大小进行分类。研究采用Giemsa染色法、H.E染色法和电子显微技术法对克氏原螯虾血细胞进行分类，观察到3类血细胞：透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞，它们所占的比例分别为19.9%，46.1%，34.1%。在电镜下，这3类血细胞的超微结构极为容易辨识。透明细胞通常在3类细胞中最小，核质（N/C）比最高，但无明显的颗粒；相比之下，小颗粒细胞和大颗粒细胞内部的颗粒数量逐渐增多。利用体内和体外培养技术研究克氏原螯虾血细胞对外源体（以Sephadex A-25色谱硅珠作为抗原）的包囊作用，初步探讨克氏原螯虾血细胞在对外源体免疫应答过程中的识别机理。将Sephadex A-25色谱硅珠植入克氏原螯虾体内，抗原物周围被大量血细胞包囊，通过切片技术观察到抗原物周围的血细胞绝大部分为小颗粒细胞，证实在包囊过程中起主要作用的血细胞是小颗粒细胞，即小颗粒细胞在包囊反应中比较活跃。研究结果为以后进一步研究克氏原螯虾的细胞免疫机制和提高其抗病能力提供了科学依据。     

成年日本新糠虾血细胞组成、形态及其不同发育阶段的免疫活性酶

采用光镜和电镜的方法,以血细胞所含颗粒与否,颗粒多少和核质比等将成年日本新糠虾血细胞进行分型,并对各型血细胞所占比例进行统计。利用生化分析的方法,对不同发育阶段(新孵后0、10、20和30d)日本新糠虾全组织中磷酸酶(酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)、溶菌酶和酚氧化酶的活性进行测定。结果表明,日本新糠虾血细胞可为3种类型,它们分别为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞。它们的胞体大小依次增大,核质比依次降低。对此3种类型血细胞比例分别统计后发现,颗粒细胞所占比例最多约为47.53%±0.02,其次是半颗粒细胞约为31.23%±0.01,最少的是透明细胞约为21.24%±0.02。日本新糠虾体内磷酸酶(酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)、溶菌酶和酚氧化酶的活性均有随个体发育而呈降低的趋势。3种酶中以溶菌酶的活性最高,平均约为305.20U/mg蛋白,其次是酸性磷酸酶约为0.2365U/mg蛋白,而酚氧化酶和酸性磷酸酶在成体中的活性基本一致,约为0.1295U/mg蛋白。研究表明,日本新糠虾血细胞组成中,以颗粒细胞为主。溶菌酶是其主要的免疫活性物质。日本新糠虾体内磷酸酶(酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)、溶菌酶和酚氧化酶活性有随其个体发育而逐渐...     

Percoll不连续密度梯度离心法分离红螯光壳螯虾血细胞

建立了利用Percoll不连续密度梯度离心分离红螯光壳螯虾血细胞的方法,并对配制分离体系的缓冲液以及分离体系的密度组成进行了优化。结果显示,由20%、65%和100%的Percoll组成的分离体系分离效果最优。在转速为1 810 r/min的条件下离心20 min之后,可将红螯光壳螯虾血细胞分为SGC与GC 2个细胞层。经流式细胞术分析,发现细胞层纯度均在95%以上,细胞死亡比率低于1.5%,可用于后续的细胞功能分析。此方法简单有效,为后续研究螯虾的免疫防御机制及病害防治方法奠定了基础。     

长江不同江段青虾的遗传多样性

利用20个微卫星分子标记对长江不同江段共6个青虾群体进行了遗传多样性分析,采样点包括重庆、万州、宜昌、武汉、九江和江阴。结果表明,6个青虾群体平均等位基因数(A)为5.25,平均有效等位基因数(Ne)为3.4622;20个位点平均多态信息含量(PIC)为0.5894;期望杂合度(He)由高到低依次为江阴群体(0.6308)、九江群体(0.6096)、宜昌群体(0.5945)、武汉群体(0.5934)、万州群体(0.5844)、重庆群体(0.5821),平均值为0.6296。分子方差分析(AMOVA)结果表明长江青虾6群体间遗传变异6.92%来自群体间,93.08%来自群体内部,两两群体间FST值在0.0253～0.0838(P<0.05)之间,表明群体间已明显出现分化,但分化程度中等,与湖泊青虾群体相比,长江各群体间遗传分化程度较弱,可能是由于流动的江水增加了群体间的交流。Hardy-Weinberg遗传平衡分析表明,6群体均出现杂合子缺失现象,可能是由于稀有等位基因缺失或无效等位基因造成;6群体间遗传距离为0.0620～0.1809,UPGMA聚类分析表明,江阴群体单独聚为一类,其余5个群体聚为另一类,其中...     

腐植酸钠添加剂在青虾饲料应用中的促生长效果试验

研究了在青虾饲料中添加不同含量的腐植酸钠对青虾生长速度的影响,不同饲料添加剂与腐植酸钠对青虾的促生长效果对比。结果显示：腐植酸钠作为青虾饲料添加剂在饲料中按3‰的量添加效果最佳;不同饲料添加剂中促生长效果以腐植酸钠为最优,其次是甜菜碱、L-肉毒碱、喹乙醇。     

杂交青虾“太湖1号”与日本沼虾养殖性能的比较

试验以肥满度、平均规格、饲料系数、生长速度等生长性能指标,pH值、溶解氧、氨态氮、亚硝态氮等水质指标为依据,比较"太湖1号"F1及F2代与日本沼虾的生长性能。结果显示,饲料系数从低到高依次为:"太湖1号"F1<日本沼虾<"太湖1号"F2,其中F1和F2差异显著(P<0.05)。平均规格及上市成虾比例从高到低依次为:"太湖1号"F1>"太湖1号"F2>日本沼虾,其中F1代显著高于日本沼虾(P<0.05)。"太湖1号"的肥满度与日本沼虾差异不明显。9—10月吃食旺盛季节,杂交青虾"太湖1号"的体质量与体长均高于日本沼虾,其中,F1代达到显著水平(P<0.05),但体质量与体长的瞬时增长率优势不明显。9—10月份"太湖1号"F1养殖池的氨态氮、亚硝态氮等水质指标显著低于F2和日本沼虾池,而溶解氧与pH值的差异不大。养殖效益分析表明,尽管杂交青虾的增产优势不明显,但因其规格大,销售价格高,其产值与净利润仍高于日本沼虾,且F1代达到显著水平(P<0.05)。所以,杂交青虾"太湖1号"F1代的养殖性能显著优于日本沼虾,但F2代的生长优势不明显。     

杂交青虾“太湖1号”和日本沼虾抱卵量的比较

分别对杂交青虾＂太湖1号＂和日本沼虾各40尾进行测量,对其抱卵量进行计数,并利用Microsoft Excel软件进行数据统计、t-检验及回归分析,比较了它们的绝对繁殖力与相对繁殖力。结果表明：杂交青虾＂太湖1号＂的绝对繁殖力与相对繁殖力极其显著高于日本沼虾（P〈0.01）,两种虾的抱卵量与体长、体重呈正相关,单位体长抱卵量与体长、体重也呈正相关,单位体重抱卵量与体长、体重无明显相关性。     

白洋淀水域夏季细菌群落结构及与环境因子的关系

为了解白洋淀水域细菌多样性,于夏季采集水样进行水质和微生物群落结构分析。水质分析显示,白洋淀平均酸碱值(pH)为7.95,溶解氧(DO)为16.67 mg/L,属于偏碱性湖泊且含氧量丰富。通过Illumina NovaSeq6000高通量测序分析微生物群落结构表明:白洋淀不同采样点Chao1指数、Ace指数均较高,Shannon指数为7.151~8.443,Simpson指数为0.986~0.992,反映出白洋淀各采样点微生物群落多样性丰富、稳定性好,且细菌丰富度和多样性均以光淀(GD)最高。变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)是湖水的优势菌门,丰度之和能达到90%,且以变形菌门(Proteobacteria)为绝对优势菌门,丰度为44.15%~60.18%;在属水平上烧车淀(SCD)和枣林庄(ZLZ)以多核杆属(Polynucleobacter)为第一优势菌属,其余采样点优势菌属为unidentified_Cyanobacteria。CCA(canonial correspondence analysis)分析表明,pH和DO是影响白洋淀细菌群落结构的主要环境因子。     

间歇性饥饿对日本沼虾生长和几种消化酶的影响

在(25.0±1)℃范围条件下,对日本沼虾进行了不同时间的饥饿处理后再投饵的恢复生长实验。对照组连续饱食投喂18d,处理组分别饥饿2、4、8d,再分别饱食投喂16、14、10d。实验结果显示:在恢复生长时期,处理组的特殊生长率、摄食率、食物转化率明显高于对照组,胃蛋白酶、类胰蛋白酶、脂肪酶的活性变化趋势相同,均随着先饥饿再饱食的顺序先下降再上升,但脂肪酶比蛋白酶变化趋势明显;而淀粉酶的变化趋势与之相反是先上升后下降。实验结果表明,日本沼虾继饥饿后再恢复喂食出现完全或部分补偿生长效应不仅由于增加食欲,提高摄食水平,同时改善了食物转化率。因此,补偿生长是这两种生理因素共同作用的结果。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

白洋淀围栏养蟹蟹种放养数量的探讨

针对白洋淀围栏养蟹测定出河蟹一昼夜中的摄食节律,然后用r和t检验河蟹体重与日摄食量的关系成正相关,测得体重与日摄食量关系式为:D=0.99189+0.03029W根据白祥淀围栏的供饵能力,计算出蟹种放养数量为300～500只/0.0667hm~2。     

日本沼虾养殖过程中氨基脲存在特征研究

为探究不同生长时期养殖日本沼虾(Macrobrachium nipponense)体内氨基脲(Semicarbazide,SEM)的存在特征与变化规律,从养殖池塘采集不同生长时期日本沼虾样品,对各组织中SEM含量进行测定。结果表明:不同生长阶段日本沼虾样品中均有SEM检出,肌肉、甲壳、附肢、眼柄、鳃、肝胰腺中总SEM含量分别为(6.88±0.15)^17.11±0.62、(107.30±1.10)^306.09±8.69、(243.90±8.55)^{532.31±26.27}、(85.27±3.19)^122.82±2.60、(48.43±2.13)^85.60±1.33、(13.51±1.15)^25.94±1.78μg/kg,呈现:附肢>甲壳>眼柄>鳃>肝胰腺>肌肉的含量分布特征。SEM在肌肉和肝胰腺中主要以游离态形式存在,游离态SEM所占平均比例分别为67.35%和72.4%,在甲壳、眼柄、附肢、头胸部和鳃中主要以结合态形式存在,结合态SEM所占平均比例分别为89.50%、87.16%、85.68%、80.48%和73.30%。随着养殖过程进行,肌肉中总SEM含量总体逐渐降低,甲壳和附肢中总SEM含量呈现总体上升的变化趋势。研究结果可为甲壳类水产品中SEM残留限量标准的修订和采样技术规范的制订提供基础数据。