欧洲鳗黏膜免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了8个分泌抗欧洲鳗（Anguilla anguilla）黏膜免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株，并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。结果显示，8株单抗中IgM有2株，IgG，和IgG2。各有3株；所有单抗均与欧洲鳗黏膜免疫球蛋白呈ELISA反应阳性，腹水抗体滴度为在10^4～10^6之间。进一步实验证实，这些单抗与供试的10种水产动物常见病原菌均无交叉反应；其中3株单抗与欧洲鳗血清IgM有不同程度的交叉反应；4株单抗与黏膜免疫球蛋白有交叉反应，其中2株单抗交叉反应较弱。以上结果提示，欧洲鳗黏膜免疫球蛋白和血清IgM之间既有各自独特的抗原决定簇，又有共同抗原位点，证实欧洲鳗黏膜抗体在抗原性方面有别于血清IgM。成功制备的这8株单抗可用于鳗黏膜免疫球蛋白的检测及其结构和功能分析，为欧洲鳗黏膜免疫的进一步研究提供工具。[中国水产科学，2008，15（3）：511-515]     

中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

以纯化的中华鳖虹彩病毒为抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫鼠脾细胞经杂交融合获得了8个能稳定分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚级份分析结果表明，Mab2A4属IgA，Mab8E1是IgG2a，其他的6株单抗Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、Mab4B5、Mab5E1和Mab6F2均为IgG1。酶联免疫吸附剂测定（ELISA）分析表明，8株单抗均能特异性地识别中华鳖虹彩病毒，与EPC、CO、FHM等宿主细胞不产生交叉反应，腹水抗体的ELISA效价在10⁵～10⁶。IFA分析表明，8株单抗中仅Mab5E1没有免疫荧光反应特性，其余7株单抗均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。中和试验结果证实8株单抗均没有中和病毒的特性。应用Western-blotting进行中华鳖虹彩病毒的抗原表位初步分析，结果显示：Mab1D3和Mab2A4分别识别分子量为84 ku和35 ku中华鳖虹彩病毒结构蛋白，Mab3A1能够同时识别分子量分别为14 ku和16 ku的两条多肽，说明这3株单抗结合位点是非构象依赖性抗原决定簇，其余单抗不具备Western-blotting反应特性。这些结果提示上述单抗对中华鳖虹彩病毒抗原特异、灵敏，可用于中华鳖虹彩病毒的检测和结构蛋白分析。     

嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析

利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了AHYT—1和AHl05012株嗜水气单胞菌的菌体单抗，筛选出11个能稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株，并对这些单抗进行了特性分析。经单抗类型测定，这些单抗分属IgM、IgG2a2个亚类，且均具有ELISA反应特性，腹水抗体效价在1：10^4—1：10^6，其中单抗4G4、2H4、GH9具有免疫荧光特性。ELISA特异性分析结果表明，4G4、2H4、FA4、GH9、CF2为嗜水气单胞菌血清型特异性单抗，4G4、2H4识别同一种血清型的嗜水气单胞菌分离株，而FA4、GH9、CF2却识别另外一种血清型的嗜水气单胞菌，并且与其他血清型的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应。Western-blot结果表明，单抗4G4、2H4、FA4所针对的抗原是菌体脂多糖(LPS)，且它们所识别的LPS抗原表位不同。菌体单抗研究结果表明，4G4、2H4和GH93株单抗可应用于嗜水气单胞菌的诊断和血清分型。本研究目的旨为建立一种快速诊断鱼类嗜水气单胞菌病的方法和血清分型方法。     

欧洲鳗鲡血清免疫球蛋白纯化及其结构分析

应用亲和层析技术提纯欧洲鳗鲡免疫球蛋白（Ig），并对欧鳗Ig的结构和抗原性进行分析。层析结果表明：Ig蛋白呈现一个锐形曲线，蛋白峰与抗原活性峰高度重叠。SDSPAGE分析表明：欧鳗Ig重链分子量为68 kD，轻链有3条，分子量分别为21 kD、23 kD和26 kD。凝胶电泳结果显示：在非变性非还原条件下，欧鳗Ig有790 kD和350 kD 2条蛋白带，在变性非还原条件下有790 kD、593 kD和350 kD 3条蛋白带。Western-blotting试验证实：兔抗欧鳗Ig能识别欧鳗Ig的多种不同聚合体和Ig的重链，但不能识别Ig的轻链。结论：欧鳗Ig在自然条件下可能以四聚体和二聚体的形式存在，这与其它硬骨鱼的Ig形式有差异。欧鳗Ig链间二硫键不健全,在SDS作用下可解聚产生多种不同分子量的聚合体，首次揭示欧鳗Ig的轻链有3种异型。     

罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用

罗氏沼虾肌肉白浊病（whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii）是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病，发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状，死亡率高达60％以上，作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachiium rosenbergii Nodavirus，MrNV）的基础上，用MrNV免疫BALB／c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2／0鼠骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA筛选阳性孔，经有限稀释法克隆，得到12株能特异分泌抗MrNV的单兜隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞。注射小鼠，制备腹水单克隆抗体，ELISA效价为1：10^5～10^6。亚型鉴定结果表明，有6株单抗为IgG1型，4株甲抗为IgG2a型，2株单抗为IgG2b型。12株单抗与对虾白斑综合征病毒（WSSV）和桃拉综合征病毒（TSV）均无交叉反应：挑选效价高的腹水单抗2B5，建立了检测罗氏沼虾诺达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定（TAS—ELISA）法，该方法检测灵敏度达0．98ng左右。Wesrtem blot分析表明，2B5能与MrNV 43kD的外膜蛋白特异性结合。     

抗传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。     

传染性胰腺坏死病毒VP2COE蛋白单克隆抗体的制备及与初步应用

为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。     

欧洲鳗鲡生物学特性及饲养技术

阐述了欧洲鳗鲡的生物学特性和丹麦工厂化－加热循环水饲养欧洲鳗技术，并就养殖设施、营养和饲料、鳗病防治、成鳗的收获和运输等作了简要介绍。     

欧鳗康的研制及其养殖结果

欧鳗是从欧洲引进到中国南部养殖的鳗种，由于地磁场变化、时差变化和气候环境变化的影响，欧洲鳗不适新的环境而出现各种不适应症状，致使体质衰弱和抗御外邪人侵的能力差。因此，在养殖过程中经常出现大量死亡，而且生长速度缓慢，饲料效率低，这是妨碍欧鳗养殖发展的一大问题。如何研制出适应欧鳗的生理要求、配比合理的饲料，这是目前众多学者所关注的问题。为此，厦门健成水产科技研究所从93年起率先开始从事欧鳗饲料的研究，研制出“欧鳗康”，先后在广东省欧鳗养殖试验场和广东饶平县仙洲养鳗场、浮山镇丰盛养鳗场、汤溪养鳗场、福建…     

抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究结果表明,成功制备的抗DA单克隆抗体杂交瘤细胞株稳定、高效,为利用该单抗研制快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下基础。     

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）为抗原免疫Balb/c小鼠，而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合，以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞，阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分，且多个荧光信号相连呈现链圈状，有限稀释 法克隆阳性杂交瘤细胞，三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株（1A8、1D7、2B6、2D11）。应用Western-blotting法分析单抗识别蛋白的分子量，结果显示，单抗1D7 和2B6均能特异性结合一条分子量116 kD病毒多肽；应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇，结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围，且背景清洁，无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116 kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白，且具有线性抗原决定簇。     

溶藻弧菌单克隆抗体的制备及应用

小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0与经溶藻弧菌(1.1587)免疫的BALB3/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合,有45.8%的培养孔有杂交瘤细胞生长,其培养上清液抗体阳性率为77.4%.经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞,获得7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3,AD1-F3,AD2-E7,AD2-F7.取AD1-F3扩大培养,注射小鼠,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水,滴度为11000.该腹水与其他3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应,与其他13株标准菌株无交叉反应.利用制备的单抗腹水,建立了检测溶藻弧菌的单抗-ELISA技术.该反应系统可应用于溶藻弧菌的快速诊断,反应时间为6-7h,检测灵敏度为104cells·-1.并利用该检测方法进行了11份待测菌样本溶藻弧菌的检测.     

Generation of mouse monoclonal antibodies specific to tilapia immunoglobulin using fish immunoglobulin/BSA complex for monitoring of the immune response in Nile tilapia Oreochromis niloticus

The simple immunoprecipitation method was used to isolate tilapia immunoglobulin (Ig) for immunization in order to produce monoclonal antibodies (MAbs) specific to tilapia Ig. First, the tilapia antiserum against bovine serum albumin (BSA) was prepared by peritoneal injection of BSA into tilapia, and the tilapia anti‐BSA antiserum was used to precipitate BSA to form the Ig/BSA immune complex. The Ig/BSA immune complex was then injected into Swiss mice for hybridoma production. After fusion, three hybridoma clones producing MAbs specific to the tilapia antibody were selected by dot blot and Western blot. All MAbs (101A, 59G, and 11A) were bound specifically to the heavy chain of immunoglobulin M (IgM). The MAbs 101A and 59G demonstrated twofold higher affinity than MAb 11A and the commercialized antibody. However, MAbs 11A could also bind to the heavy chain of IgM in Asian seabass, Lates calcarifer, as well. These MAbs can be used to monitor the immune responses of individual fish by indirect ELISA upon exposure to various antigens.     

Monoclonal antibodies against Vibrio salmonicida: the causative agent of coldwater vibriosis ('Hitra disease') in Atlantic salmon, Salmo salar L.

Abstract. Monoclonal antibodies (Mab) directed against Vibrio salmonicida were produced and partially characterized. The bacterium is the causative agent of 'Hitra disease' or cotdwater vibriosis (CV) and differs from all other Vibrio bacteria tested so far with respect to a unique surface antigen (VS-P1). Thirteen hybridoma clones produced antibodies which exclusively reacted with this antigen in ELISA. The remaining four clones reacted against undefined determinants and were partly cross-reactive to V. anguiilarum, V. ordalii and V. fischeri . Fifteen Mab were of IgG1/kappa and two of the IgG3/kappa isotypes. Eleven of the IgG1 plus the two IgG3 Mab reacted with the VS-P1 molecule.     

欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析法结合柱层析提取，纯化欧洲鳗血清免疫球蛋白（Ｉg) ,实验证实欧洲鳗Ｉg主要分布在硫酸铵饱和度３０％－５０％的区间内，Ｓephacry1-S200进一步提纯的Ｉg主要存在于第一个蛋白峰，而Ｓepharose-4B柱层析提纯的Ｉg则存在于第二个蛋白峰，ＤＥＡE-52脑子交换柱层析可进一步纯化Ｓepharose-4B柱层析的产物，ＥＬＩＳＡ和Western-blot分别证实上述提取物具有抗体的免疫学活性，ＳＤＳ－ＰＡＥＧ分析纯化的Ｉg，显示了洲鳗Ｉg重链约为６８kD，轻链约为２６kD.     

Antibody production in Japanese eels, Anguilla japonica Temminck & Schlegel

Adult Japanese eels, Anguilla japonica Temminck & Schlegel, (200–250 g, 45–55 cm) were immunized by intramuscular injection with goat IgG. After 5 weeks, eel immunoglobulin (Ig) was purified using affinity chromatography. The purified eel Ig was used to immunize rabbits to produce anti-eel Ig antibody. The highest antibody ELISA value in eels was reached 3 weeks after initial immunization with goat IgG, and then gradually decreased. The antibody could still be detected at 140 days post-immunization. The optimal temperature for antibody production was 30°C. Freund's complete adjuvant and secondary immunization both increased antibody production in eels.     

Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity

ABSTRACT:   Samples of colloidal chitin and chitosans with deacetylation degrees (DD) of 50, 65, 75 and 95% (DD50, DD65, DD75 and DD95, respectively) were prepared from shrimp chitin. The hydrolytic activity of cellulase on these samples increased with the increasing DD of chitosan, with DD95 being the most easily hydrolyzed. Colloidal chitin was hardly hydrolyzed. The optimal reaction temperature and pH for cellulase digestion of chitosan were 55°C and pH 5.2, respectively. During cellulase digestion of chitosan, the 9-h hydrolysate had the highest enhancing effect on the proliferation of a human hybridoma cell, HB4C5. This hydrolysate is composed of low-molecular-weight chitosan (LMWC), with a molecular mass of 20.0 kDa, and chitooligosaccharides, which are composed of sugars with a degree of polymerization of 1–6. In vitro , the 9-h hydrolysate increased both cell proliferation and immunoglobulin (Ig)M secretion of HB4C5 because of the presence of chitooligosaccharides for the former activity and LMWC for the latter activity. In vivo , samples of the chitosan hydrolysate, chitooligosaccharide mixture and LMWC significantly increased the levels of serum IgG and IgM, and enhanced concanavalin A- and lipopolysaccharide-induced proliferation of mouse lymphocytes.