黄鳝卵巢初次发育成熟及相关基因表达分析

为探讨黄鳝卵巢发育规律,观察了实验室养殖条件下黄鳝卵巢初次性成熟过程,采用定量PCR分析了gdf9(growth differentiation factor 9)、cyp19a1a(P-450 aromatase)、amh(antiMüllerian hormone)和amhrⅡ(anti-Müllerian hormone type Ⅱ receptor)基因表达水平.结果显示,4至9月龄黄鳝卵巢中卵母细胞处于初级生长期,胞质中嗜碱性巴尔比尼小体数量先增后减,形状由点变为大团块状,后又缩小.10月龄时,黄鳝卵巢青春期启动,进入次级生长期；部分卵母细胞出现皮质小泡,巴尔比尼小体消失或残存为点状.1龄时,卵巢中卵母细胞生发泡偏位或消失,达到成熟状态.卵巢中gdf9表达水平在4至12月龄都较高,变化不明显；cyp19a1a、amh和amhrⅡ表达变化趋势类似:从4月至7月龄上升,8月龄下降,10月龄又上升.研究表明,实验室养殖条件下,黄鳝卵巢10月龄左右启动青春期,1龄左右可达性成熟；cyp19a1a、amh和amhrⅡ表达可能与卵巢青春期启动相关.     

灰鲳卵巢发育的组织学研究

采用常规的生物学调查方法并取其卵巢做石蜡切片,用显微镜观察灰鲳(Pampuscinereus)的卵巢发育,进行组织学研究。对灰鲳卵巢中的卵母细胞的各个时相的形态特征进行了较为详细的描述;对灰鲳卵巢的周年变化进行了分析,结果显示,灰鲳卵巢发育可为6个时期,繁殖期在6～8月,8月下旬起至9月中旬卵巢开始退化,9月中、下旬起卵巢进入重复发育的Ⅱ期,直到翌年3月都停留在重复发育的Ⅱ期,4月初部分灰鲳卵巢开始重新发育。灰鲳的卵巢平均成熟度在0.3%～12.3%之间。研究表明,灰鲳属多次产卵类型的鱼类。     

施氏鲟卵巢发育的组织学观察

对人工养殖施氏鲟卵巢发育的不同时期(1～8龄)进行了组织学观察,结果表明：1龄施氏鲟处于性分化早期,卵巢中卵原细胞形成增殖团;2～3龄鱼卵巢为Ⅰ期,第1时相的初级卵母细胞直径10～60μm,核大,位于细胞中央,染色质均匀分布;4～5龄卵巢为Ⅱ期,第2时相小生长期的初级卯母细胞直径60～200μm,核内含有7～26个核仁;6～7龄卵巢Ⅲ期,第3时相大生长期的初级卵母细胞直径200～1600μm,卵母细胞内出现脂肪滴、卵黄颗粒和色素颗粒。细胞膜有完整的3层结构。8龄卵巢Ⅳ期,第4时相晚期初级卵母细胞直径1600～3300μm,细胞核膜消失,核仁溶解,核由中心向动物极受精孔移动;V期卵巢的第5时相生殖细胞为成熟的卵细胞,直径3400～3750μm,从滤泡膜中释放到体腔内;Ⅵ期为产卵后的卵巢,以第2时相的卵母细胞为主：根据研究结果推测,施氏鲟卵巢再次成熟的周期为3～4年。     

锯缘青蟹卵巢发育的组织学观察

根据锯缘青蟹卵巢的外部形态和内部组织学特征,卵巢发育可以划分为六个时期:未发育期、发育早期、发育期、将成熟期、成熟期和排卵后期。在发育早期,多数卵母细胞胞质中有多个嗜酸性液泡,这种结构在其他十足类卵母细胞中较少见。少数个体在发育早期发生卵母细胞全面退化,这种现象可能是缺乏交配或饥饿造成的。     

雌激素拮抗剂对三疣梭子蟹卵巢发育及相关基因表达的影响

通过活体注射、养殖实验和荧光定量PCR等方法,研究了不同浓度他莫昔芬(TAM)对三疣梭子蟹雌体成活率、卵巢指数、肝胰腺指数及卵巢发育相关基因表达的影响。结果显示,不同浓度TAM对雌体存活率和肝胰腺指数均无显著影响,但在一定程度上抑制了卵巢指数。不同组织中的卵黄蛋白原(Vg)、雌激素相关受体(ERR)、维甲酸受体(RXR)和蜕皮激素受体(Ec R)基因表达均受到了TAM的影响,Vg基因在卵巢和肝胰腺中的表达水平明显受到TAM的抑制;低浓度TAM组(6.7和13.4μg/g)促进了卵巢和胸神经节中的ERR基因的表达,但高浓度TAM(20μg/g)抑制了大部分组织中ERR基因表达水平;外源注射TAM对三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中的Ec R基因表达的变化模式与ERR基因基本相似;此外,低浓度TAM促进了卵巢中RXR基因的表达,对肝胰腺中RXR基因表达无显著影响。研究表明,TAM通过抑制Vg基因表达影响卵巢发育,同时ERR和Ec R可能参与了雌激素或雌激素拮抗剂对三疣梭子蟹卵巢发育的调控过程。     

南美白对虾健康养殖技术-2.南美白对虾的人工繁殖

根据肉眼观察卵巢的大小、颜色和组织切片中卵细胞发育最大一期的面积，将南美白对虾的卵巢发育分为5期^[1,2]。     

鲂成熟卵巢发育的组织学观察

通过组织学观察，论述了鲂卵巢发育各时相卵母细胞的演化规律及周年变化特点。鲂卵巢发育属分批同步型，在天然水域中属一次产卵类型     

蓝蟹抱卵期间卵巢第二次发育过程中主要脂肪酸和脂类的变化

利用气相色谱和棒状薄层色谱扫描仪对蓝蟹(Callinectes sapidus M.J.Rathbun 1896)抱卵期间卵巢第2次发育过程中的主要脂肪酸和脂类的变化进行研究.结果表明,在蓝蟹抱卵期间卵巢第二次发育过程中,C16:0、C16:1n7、C22:6n3占总脂肪酸的比例随着卵巢指数的增加而增加,并且和卵巢指数之间存在显著相关性(P＜0.05):C18:0和C20:4n6(ARA)的比例随着卵巢指数的增加而减少,并且和卵巢指数之间存在显著相关性(P＜0.05):C18:1n7、C18:1n9和C20:5n3的比例随着卵巢指数的增加略有减少,和卵巢指数之间不存在显著相关性(P＞0.05).甘油三酯(TG)的比例随着卵巢指数的增加而增加,和卵巢指数之间存在显著相关性(P＜0.01);游离脂肪酸(FFA)的比例随着卵巢指数的增加而下降,和卵巢指数之间存在显著相关性(P＜0.05):胆固醇(CHO)的含量随着卵巢指数的增加而下降,和卵巢指数之间存在显著相关性(P＜0.01):磷脂(PL)的含量随着卵巢指数的增加基本保持不变,和卵巢指数之间不存在相关性(P＞0.05).以上数据可为蓝蟹亲蟹培育的饲料配方提供参考依据.     

东海鳓卵巢发育的组织学观察

于光镜于对东海鳓卵巢切片作了组织学观察，结果表明，5月－7月为东海鳓的繁殖期，其卵巢在Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ－Ⅳ‘期和Ⅴ‘期，8月－9月鳓卵巢处在产后休整阶段；10月－翌年2月为越冬Ⅱ期卵巢；3月－4月卵巢处在产前发育阶段，在小生长期，卵核的体积较核质的体积增大快，核质比大，大小长期，随着卵黄物质的积累，卵母细胞体积快速增加, 比下降。在鳓卵母细胞发育中，曾见有两层卵膜结构，但接近成熟的卵母仅有一层卵膜。东海鳓的产卵方式为短期分批产卵类型。在一个生殖周期内，一般产卵2次。     

池塘养殖刀鲚卵巢发育的形态及组织学研究

采用石蜡连续组织切片和扫描电镜技术,对池塘养殖刀鲚(Coilia nasus)卵巢的各个发育阶段进行了形态和组织学研究,并对卵母细胞各个时相的形态特征进行了较为详细的描述,分析了刀鲚卵巢发育的周年变化规律和产卵类型.结果显示,刀鲚卵巢发育可为6个时期:Ⅰ期卵巢较细,呈线状,长约25 mm,以卵原细胞向初级卵母细胞过渡的细胞为主.Ⅱ期卵巢细柱状,长为40～50 mm,外观呈浅肉红色至肉黄色,2时相卵母细胞占92%以上;Ⅲ期卵巢呈肉色直至浅青色,长55～65 mm,中部逐渐膨大,细胞处于初级卵母细胞的大生长期,由2～4时相卵母细胞组成,其中3时相卵母细胞占60%～75%,出现油滴;Ⅳ期卵巢青色直至灰色,体积急剧增大,呈囊状,约占体腔的2/3,肠大部分被掩盖,肉眼可见增大的卵粒,晚期可见游离的卵粒,细胞处于初级卵母细胞发育的晚期,油滴充满细胞,第4时相卵细胞占86%以上,最大卵径482 μm;V期卵巢柔软膨大,占据腹部绝大部分,外观呈玉绿色,卵粒充满卵巢,清晰易辨,细胞中卵黄和原生质表现出明显的极化现象,核膜消失,卵径为750～900μm;Ⅵ期卵巢为酱紫色,体积明显减小且松软,卵巢腔萎缩,以空的滤泡细胞和2时相细胞为主.刀鲚繁殖高峰期在4-6月,10月中、下旬起卵巢重新进入Ⅱ期,直到翌年2月都停留在Ⅱ期,3月下旬部分刀鲚卵巢开始重新发育.研究表明,刀鲚属一次产卵类型的鱼类,但个体间卵巢发育差异显著,产卵持续时间较长.     

莱州湾三疣梭子蟹生物学参数及生长特性研究

根据2012年5~11月使用单船底拖网进行的7个航次调查数据,运用FiSATⅡ软件相关模块对莱州湾三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)生长、死亡参数及生长特性、种群补充模式、资源量等进行研究。结果显示:7个航次共捕获三疣梭子蟹1128 ind,雌雄性比为0.96,雌性甲宽为27~227 mm,雄性为29~207mm;获得三疣梭子蟹雌性生长参数k=1.60、L_∞=241.50、W∞=639.29、t0=0.081,雄性为k=1.50、L∞=210.00、W∞=418.23、t0=0.091;经体长结构VPA(Length-Structured VPA)模块估算,稳定状态下莱州湾三疣梭子蟹雌性渔获尾数为734×10~4ind、种群尾数为1.15×10~8ind、资源量为2 682 t,雄性渔获尾数为810×10~4ind、种群尾数为1.19×10~8ind、资源量为1 929 t;经变换体长渔获曲线法(Length-Converted Catch Curve)及刀刃式选择假设模型(Knife-Edge)估算三疣梭子蟹雌性总死亡系数Z=4.17、自然死亡系数M=1.20、捕捞死亡系数F=2.97、资源开发利用率E=0.712、平均选择甲宽Lc=62.38mm、最大效益时开发利用率Emax=0.515;雄性总死亡系数Z=3.76、自然死亡系数M=1.19、捕捞死亡系数F=2.57、资源开发利用率E=0.684、平均选择体长Lc=40.84 mm、最大效益时开发利用率Emax=0.487。研究表明:1)莱州湾三疣梭子蟹雌雄性比、雌雄性幂指数均处在正常水平,总体生长状况良好;2)莱州湾三疣梭子蟹雌、雄性群体资源利用率均显著高于最适利用率与最大利用率,处于过度开发水平;3)莱州湾三疣梭子蟹现存资源量低于生态容量,上升空间较大。     

不同蛋白质、脂肪水平对三疣梭子蟹生长和卵巢色素沉积的影响

以鱼粉和豆粕为蛋白源,鱼油和大豆油为脂肪源,配制蛋白质水平分别为35％、40％、45％和脂肪水平分别为7％、9％、11％的二因子三水平的实验饲料,并以鲜杂鱼饲料为对照,对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(体质量36.5～42.9 g)进行为期20周的养殖实验,研究三疣梭子蟹对蛋白质、脂肪的需要量,以及对卵巢色素沉积的影响.养殖实验采用海区串笼吊养方式,每个吊笼放养1只雌蟹.实验共10个处理,每个处理18个蟹,3个重复.结果表明,不同蛋白质、脂肪水平饲料对三疣梭子蟹增重率(269.2％～404.90％)、饲料系数(2.01～2.55)、蛋白质效率(1.02％～1.29％)和肥满度(16.26％～23.97％)均有显著影响（P＜0.05）；增加饲料蛋白质和脂肪水平,可显著提高三疣梭子蟹生长,降低饲料系数（P＜0.05）.对照饲料组的三疣梭子蟹获得了最高的增重率(461.69％),但饲料系数也是最高(6.35),而且肥满度(21.15％)低于P40Lll组（蛋白质40％、脂肪11％组）.三疣梭子蟹水分、肌肉蛋白、脂肪、灰份和卵巢灰份不受饲料蛋白质、脂肪水平变化的影响(P＞0.05),但卵巢蛋白质、脂肪影响显著(P＜0.05),而且高蛋白饲料组的卵巢脂肪含量总是显著低于其他各组.在同一饲料蛋白质水平下,9％脂肪饲料组的三疣梭子蟹卵巢类胡萝卜素总量、虾青素含量和成色比色值都显著高于其他各饲料组（P＜0.05）.与对照饲料组比较,实验饲料组的三疣梭子蟹卵巢类胡萝卜素总量和虾青素含量呈显著优势.综合考虑生长、饲料系数和色素沉积,三疣梭子蟹饲料的适宜蛋白质水平和脂肪水平分别为40％～45％和9％.本研究旨在为制定三疣梭子蟹饲料配方和改善其品质提供理论依据.     

三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法。结果表明:(1) SDS-PAGE 显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66 ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2) 样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8 h,一抗和二抗反应时间分别为2 h和1 h,显色时间为20 min;(3) 该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+0.399 1(R²=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD₄₅₀值,工作范围为200～900 ng/mL;(4) 应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。     

三疣梭子蟹卵巢发育过程中雌二醇的免疫定位和变化

雌二醇(estradiol,E_2)是甲壳动物体内重要的性类固醇激素,对其卵巢发育和卵黄发生起着十分重要的调控作用。本实验采用免疫组织化学方法系统研究了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神经节、脑神经节和大颚器中的分布及变化。结果表明:(1)蟹卵巢中E_2的免疫阳性主要分布于滤泡细胞和卵巢发育中后期的卵母细胞细胞质(II-V期),卵巢发育过程中卵母细胞细胞质和细胞核中的E_2免疫阳性均为先上升后下降的趋势,最大免疫阳性分别出现在IV期和II-III期,滤泡细胞中始终存在较强的E_2免疫阳性;(2)肝胰腺中的E_2免疫阳性主要分布于F细胞及R细胞细胞核中,R细胞细胞核中的E_2免疫阳性从III期开始显著下降,F细胞中始终存在较强的E_2免疫阳性;(3)卵巢发育(I-V期)的神经组织,E_2主要分布于胸神经团的神经细胞和神经髓质以及脑神经节神经细胞细胞核内,其中脑神经节神经细胞细胞核中始终保持着强免疫阳性,卵巢发育早期(I-II期)胸神经团中的神经髓质中为E_2中等免疫阳性,神经细胞中一直为弱免疫阳性;(4)就大颚器而言,E_2强免疫阳性始终存在于大颚器腺细胞的核仁以及细胞核周围的细胞质内。以上结果表明,E_2在三疣梭子蟹卵巢、肝胰腺、神经组织和大颚器中广泛分布,且免疫阳性与卵巢发育具有一定的相关性,E_2可能通过作用于多个靶器官来调控三疣梭子蟹的卵巢发育。     

三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库构建及EST初步分析

三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive prote in-1、profilin和m asquerade-like prote in,且4个免疫相关基因共有48个克隆,占测序总克隆的68.6%,表明血细胞中免疫相关基因表达非常活跃。研究结果证实,构建血细胞全长cDNA文库是大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因的可靠途径,并为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。     

三疣梭子蟹卵黄蛋白的纯化和部分生化性质

通过电泳法检测到了三疣梭子蟹卵巢中的卵黄蛋白,采用EDTA-Mg2+沉淀法以及凝胶过滤(Sephadex-100)对该蛋白进行了纯化,并通过相关染色和光吸收法确定该蛋白为糖脂磷类胡萝卜素蛋白;梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示该蛋白的总分子量为362.5 ku,由分子量为102.3 ku、66.1 ku、38.9 ku三个亚基组成。     

东海三疣梭子蟹成熟群体生殖特征和条件状况

为了探求东海三疣梭子蟹成熟群体的发育生殖机制,采用生态学、资源生物学等相关研究方法,通过对三疣梭子蟹性腺、肝胰腺及条件指数等指标的研究,初步建立起雄性三疣梭子蟹成熟阶段发育分期的特征变化,反映了目前东海三疣梭子蟹成熟群体的生殖特征和条件状况。三疣梭子蟹生殖群体由1龄蟹为主,规格偏小。头胸甲宽主要分布在100~160 mm之间,体重为50~200 g。头胸甲宽与长呈线性相关,而头胸甲宽、长与体重则呈幂函数关系。成熟阶段输精管发育程度和头胸甲宽正显著相关。根据三疣梭子蟹输精管的粗糙程度、管径及管重大小,本文首次提出把处于成熟阶段的雄蟹分为5个阶段。输精管重增长为幂函数方式,输精管指数则随发育线性增长。雌蟹卵巢发育规律和头胸甲宽之间关系不甚明显,而和季节相关。研究表明,9月份三疣梭子蟹交配后卵巢迅速发育,增长明显,10~12月份生殖群体卵巢普遍处于Ⅱ~Ⅳ期。三疣梭子蟹肝胰腺重量随体重和甲壳的增长而增加,而肝体指数相反。雌蟹卵巢Ⅱ期阶段梭子蟹肝胰腺重量最高,平均重量为18.21±5.68 g,随后逐渐降低,说明肝胰腺能量发生了转移;相比于雄蟹,雌蟹储能更多。雌蟹卵巢重量随肝胰腺重量变化呈对数关系增长,而雄蟹输精管重随肝胰腺重呈线性。三疣梭子蟹生殖群体在发育变化过程中两个条件指数基本处于一个平衡阶段,雌雄间差异变化不大。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

三疣梭子蟹池塘养殖初步研究

<正> 三疣梭子蟹Portunus trituberculatus(Miers)隶属梭子蟹科Portunidae,梭子蟹属Portunus。浙北俗称“枪蟹”,浙南俗称“江蟹”或“蜞”(闽语),台湾亦称“截”。是一种暖湿性多年生食用蟹。我国渤海、黄海、东海和南海沿海以及朝鲜、日本、菲律宾近海,均有分布。三疣梭子蟹一向是捕捞主要对象,也是我国出口创汇的重     

三疣梭子蟹患"乳化病"后几种保护酶活力的变化

以酶活力试剂盒测定法研究三疣梭子蟹患“乳化病”后主要病变组织中保护酶系统的病理变化。以患病三疣梭子蟹的肝胰腺、鳃、心肌及步足肌组织为材料，研究4种组织中淀粉酶（AMS）、超氧化物岐化酶（SOD）、溶菌酶（Lysozyme）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、谷草转氨酶（AST／GOT）和谷丙转氨酶（ALT／GPT）8种酶活力及丙二醛（MDA）指标的变化。试验结果表明：病变后梭子蟹4种组织中9种指标均存在不同程度的病理变化，表明酶活力指标可以作为乳化病病理分析的重要参考依据。