坛紫菜品系间杂交分离色素突变体及其特性的初步研究

以野生选育的坛紫菜(Porphyra haitanensis)为母本,诱变选育全棕红的品系为父本进行杂交实验,从杂交子代大量叶片中,筛选出1株褐黄色素突变体、1株翠绿色与野生色相嵌的嵌合体和1株褐绿色与野生色相嵌的嵌合体。通过酶法分离突变体的营养细胞,单性生殖获得丝状体;分别使丝状体成熟并放散壳孢子,然后单株培养和筛选获得褐黄、翠绿和褐绿色子代叶状体。实验进行50 d。结果:(1)褐黄色突变体藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量低;孢子囊枝的细胞较小,且大量形成时间比亲本晚15 d;幼苗培养初期日平均生长量仅为(1.22±0.28)cm,当叶片长到60 cm左右时生长优势逐步凸显,日平均生长量可达(7.50±1.18)cm;(2)翠绿色丝状体容易成熟,发育方式特殊,营养藻丝不经过藻丝加粗阶段,直接由球形细胞发育成孢子囊枝和壳孢子囊;翠绿色叶状体藻红蛋白含量低,仅有(5.513 0±1.049 6)mg/g(干品);叶状体生长快速,60 cm长的藻体日平均生长量高达(11.95±2.33)cm;(3)褐绿色突变体藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白这3种色素蛋白和叶绿素的含量均较低;藻丝细胞短且细,叶状体生长速度较慢。     

坛紫菜杂交重组品系的选育与特性分析

坛紫菜选育品系(HR-6)具有叶状体快速生长期的前期生长较快,色素蛋白含量高,但成熟较早,生长期短,丝状体的壳孢子放散量较少等特性;坛紫菜另一个选育品系(HR-5)具有叶状体快速生长期的前期生长较慢,色素蛋白含量高,但成熟晚,生长期较长,丝状体的壳孢子放散量多等特性。为改善HR-6品系叶状体成熟较早,壳孢子放散量较少的弱点,本文以HR-6品系为父本,HR-5品系为母本进行种内杂交,从杂合丝状体产生的F1叶状体中选育出了综合性状更加优良的品系(WD-7)。在叶状体的快速生长前期(日龄30~45d),父本品系的绝对生长率为6.68cm/d,母本品系为3.63cm/d, WD-7品系为6.67cm/d;在叶状体的快速生长中后期(日龄46~60d),父本品系的绝对生长率降至5.15cm/d,母本品系则升至7.27cm/d,而WD-7品系高达11.54cm/d。父本品系的叶状体成熟最早,培养35d左右,大部分个体已成熟;WD-7品系遗传了母本品系成熟较晚的优点,日龄55d之后,大部分个体才出现成熟。日龄35d的叶状体平均厚度,WD-7品系为29.87μm,分别比父、母本品系增加了10%和16%,藻体的韧性明显增强。WD-7品系的壳孢子放散总量为183.42万个/壳,分别是父、母本品系的1.17倍和0.57倍。上述结果证实,WD-7品系不仅遗传了父本品系叶状体快速生长期的前期生长较快的特性,同时又遗传了母本品系叶状体成熟晚、生长期长、中后期生长快的优点,壳孢子放散量也比父本品系有所增加,此品系有望被培育成适宜大规模栽培的新品种。     

坛紫菜人工色素突变体的诱变与分离

坛紫菜叶状体经一定剂量的^60Cos-γ射线辐射再培养一段时间后,出现了少量色素体颜色发生变异的细胞,它们呈点状无规则地镶嵌在野生型细胞中。培养3周后,色素变异细胞分裂并形成了不同颜色的细胞块,其颜色呈桔红、桔黄、浅黄褐、浅红、紫红、紫褐、黄绿、绿色等。在辐射剂量0～1100Gy范围内,叶状体上色素变异细胞块的出现频率随着辐射剂量的增加而增加;但辐射剂量增至1．400Gy时,色素变异细胞块出现的频率反而下降,说明1100Gy是合适的辐射剂量。在同一个叶状体的不同部位上色素变异细胞块出现的频率足不同的,从基部到稍部,随着部位的上移而逐渐增加。用酶解法把含色素变异细胞的叶状体细胞单个分离出来并进行离体培养,在它们的再生体中,出现了多种单色的色素突变叶状体,从中分离到tan(红褐色)、bor(深桔红色)、ceb(紫红色)、hon(枯草色)、cac(深黄绿色)等不同颜色的纯色突变体。从各单色突变体中分离出来的丝状体,其颜色与各自的叶状体相同。各突变体的丝状体成熟后,放散的壳孢子长成单色的F1叶状体,其颜色与各自最初的母体叶状体相同,说明所得到的上述突变体是稳定的色素突变体。     

坛紫菜北移养殖试验

坛紫菜是我国特有的品种,也是闽、浙两省紫菜人工养殖生产的唯一种类,它生长快、产量高。自然分布在长江以南,北移江苏启东吕泗、山东青岛后,丝状体育苗自然水温低于27℃,不能成熟,需要采取升温措施。叶状体冬季生长缓慢,3月份温度回升后,虽仍能生长,但菜质较差。利用坛紫菜耐高温的特性,在北方9～11月养坛紫菜,其后养条斑紫菜,可望实现两茬生产。     

坛紫菜优良品系的品质分析

坛紫菜优良品系（HR-5）具有叶状体薄、味道好、生长快、壳孢子放散量大等优良特性,为了将其培育成新品种,本文对该品系和传统栽培品系（WT-dt）的海区栽培菜的粗蛋白质、总氨基酸、游离氨基酸等含量进行了测定,其结果如下：1. 一至三水菜的粗蛋白质含量：HR-5为45.2~38.0%,WT-dt为39.5~33.2%,前者的含量均显著高于后者（P＜0.05）;且随着采收期的增加,它们的粗蛋白质含量均逐渐下降。2. 两个品系的总氨基酸含量：HR-5为361.8~287.4 mg/g,WT-dt为321.8~264.8 mg/g,前者的含量均高于后者（P＜0.05）,也随着采收期的增加,它们的总氨基酸含量均逐渐下降。3. 两个品系的游离氨基酸含量：HR-5为3391.8~1983.2 mg/100g,WT-dt为2930.2~2046.7 mg/100g,一水和二水菜的游离氨基酸含量前者均显著高于后者（P＜0.05）。4.前三水菜的主要呈味氨基酸：HR-5显著高于WT-dt（P＜0.05）,且随着采收期的增加,它们的含量均逐渐下降。上述结果证实：HR-5品系的粗蛋白质、总氨基酸、游离氨基酸和主要呈味氨基酸等含量等均比WT-dt品系高,这是该新品系的味道明显好于WT-dt品系的原因所在。     

坛紫菜不同色素突变体的初步研究

初步探讨了坛紫菜Porphyra haitanensis褐色、褐绿色、翠绿色、红棕色、棕褐色、桔红色和紫色7种色素突变体的子一代叶状体形态特征、生长及4种主要色素含量的变化.3～4cm长的不同色泽幼苗经20d培养后的结果显示:(1)各色素突变体从长度、宽度、鲜重量和细胞厚度方面较野生坛紫菜均具有显著优势;在培养时间内,各色素突变体的长度日增长量均显著高于野生型坛紫菜;褐绿色、棕褐色和红棕色突变体在鲜重日增重率上表现出明显的优势,在第11～15天所有色素突变体的平均日增重率均高于野生型;(2)红棕色、棕褐色和紫色突变体的总藻胆蛋白含量明显高于野生型.紫色突变体的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量均为最高,其中藻红蛋白、别藻蓝蛋白含量为野生型的3倍.叶绿素含量均无明显变化.本研究结果为有效利用坛紫菜的不同色素突变体进行种质改良奠定了良好基础.     

坛紫菜色素突变体色素基因的表达定量分析

以野生型和6种不同色泽的坛紫菜色素突变体为材料,通过实时荧光定量PCR技术分析了4种主要色素基因(Cpeα、Cpcα、Apcβ、Chl.a)在不同色泽突变体不同生长期(初期、盛期、末期)的相对表达水平。结果表明在不同色泽不同生长期的坛紫菜色素突变体中,各色素基因表达水平由高到低均为Apcβ>Cpcα>Chl.a>Cpeα,且Cpeα基因的表达水平最不稳定,会随着生长过程发生显著变化,而Cpcα、Apcβ和Chl.a基因表达水平则相对稳定;此外,对色素突变体和野生型藻体中色素基因表达水平和相应色素蛋白含量的线性相关回归分析结果表明二者间没有相关性,即各色素基因的表达水平与藻体最终显示的颜色无关,由此推测坛紫菜色素突变的可能机制是色素蛋白合成过程中一些相关调控基因突变所致。     

坛紫菜杂交品系优势的初步评价

通过坛紫菜诱变选育品系和野生选育品系间杂交,筛选出了4个经济性状优良的杂交品系(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ);杂交品系的子代表现出较大的杂交优势,既具有亲本优势,又具有超亲优势;品系Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的3～5cm幼苗经过10d培育,平均日增重量的超标优势分别达12.35%、139.78%、107.57%和173.52%;杂种优势指数达99.83%、213.07%、184.44%和243.05%;品系Ⅱ耐高温能力较强,在29℃水温中可正常生存10d以上;品系Ⅲ在4个杂交品系中生长最快,培育20d时藻体的平均长度是父本的1.29倍,总藻胆蛋白含量最高,达(103.83±0.49)mg/g干品;品系Ⅳ和Ⅴ藻体宽而薄,不易腐烂和老化,其中品系Ⅳ叶绿素含量高达(9.79±0.48)mg/g干品,比母本高46.21;从杂交品系的性状稳定性来看,品系Ⅱ的F2和F3叶状体长度生长相对稳定,品系Ⅲ的F3叶状体经过选育后,生长性能比F2叶状体更加突出。和F2叶状体相比,品系Ⅳ的F3各项指标表现出较大的稳定性。本研究为坛紫菜杂交育种的应用积累了有用资料。     

坛紫菜体细胞单克隆叶状体途径及海上养殖

用海螺酶酶解坛紫菜叶状体制备游离的营养细胞,在显做镜下挑选出单个细胞放入96孔板,在20℃,1500～2000 lx,12D:12L条件下进行隔离培养。一部分细胞直接发育形成了叶状体:一种途径是单个细胞通过典型的两级分裂发育成叶状体,也有一些单细胞先形成叶片状的细胞团,然后在细胞团一端形成假根;另一种途径是部分单细胞先形成“愈伤组织”,经过一段时间培养后放散出类似“孢子”的细胞,其中部分“孢子”发育成叶状体。由单细胞克隆培养获得的叶状体经组织培养形成纯合丝状体,这种纯系丝状体扩大培养后转入传统的育苗途径下海养殖。纯系在苗网附着率、叶片质量和性成熟时间等经济性状方面比未经选育的普通种有优势。     

坛紫菜的细胞学观察

为了阐明雌雄异体紫菜减数分裂的发生时期,对坛紫菜生活史的各阶段进行了细胞学研究.用卡诺固定液(无水酒精:冰醋酸=3:1)分别固定室内培养的坛紫菜各生活阶段的活体材料,在明亮处放置数日使细胞褪色至白色.然后,先用铁矾苏木精染液对固定材料进行染色处理,再进行压片、显微观察和拍照记录.观察结果表明,精子囊细胞、叶状体营养细胞和2个细胞的壳孢子萌发体中的核相是单倍的,染色体数N=5;果孢子、丝状体细胞、膨大细胞和壳孢子的核相是双倍的,染色体数2N=10.精子囊细胞、果孢子和丝状体细胞的分裂是有丝分裂.在壳孢子萌发的第1次细胞分裂过程中,观察到了减数分裂的细线期、偶线期、双线期、终变期、中期和后期等;壳孢子萌发的第1次细胞其分裂结果导致了染色体数目减半.上述研究结果表明,在雌雄异体的坛紫菜生活史中,壳孢子萌发的初始分裂是减数分裂.     

坛紫菜抗高温品系的筛选

坛紫菜抗高温品系的筛选=Selection of a high-temperature resistant strain of Porphyra haitanensis (Rhodophyta)［刊,中］/严兴洪（上海水产大学,上海200090）,马少玉//水产学报,—2007,31(1).-112～117 从已获得的4种坛紫菜优质高产品系中,筛选出抗高温的优良品系YZ-3。在28 ℃和29 ℃下培养15 d后,YZ-3品系的壳孢子成活率分别达73.2%和52.6%,分裂率分别为100%和82.8%;而对照组野生型（WT）品系的壳孢子成活率分别只有10.3%和4.6%,分裂率分别为89.7%和65.9%;YZ-3品系的壳孢子成活率和分裂率均远高于WT品系。把在常温(24 ℃)下培养35 d的壳孢子苗,再分别培养在24、28和29 ℃作抗高温试验,培养25 d后发现,YZ-3品系的幼苗平均体长分别增加了33.6、23和15倍,而WT品系的苗平均体长分别只增加了7.7、1.4和0.9倍;YZ-3品系的苗平均体长分别是WT品系的3.8、8.8和7.4倍。在28 ℃和29 ℃组,WT品系幼苗培养15 d就大面积腐烂; 而YZ-3品系幼苗培养25 d也不腐烂。上述结果表明YZ-3品系是抗高温的。图6表3参15 关键词：坛紫菜;叶状体;品系;高温;壳孢子;生长 E-mail：xhyan@shfu.edu.cn     

坛紫菜叶状体的细菌性红烂病研究

本实验对发生在福建省平埠岛自然海区的野生坛紫菜（Porphyra haitanensis）叶状体上的红烂病进行了研究。患病叶状体上存在大小不等、肉眼可见的圆形或亚圆形病斑,镜检发现病斑内存在大量铁锈红色的死细胞和少量已解离的发绿或发白死细胞。将患病叶状体与健康坛紫菜叶状体共培养3d后,后者也出现了相同的红烂病,表明该病是由传染性病原侵入引起的。从患病叶状体中分离到一种病原菌,能感染健康叶状体使其出现相同的病症。该病原菌具有分泌毒素和微弱的消化琼胶能力,经高压灭菌或煮沸后的病原菌液,其杀死紫菜细胞的能力比未处理的病原菌液增加了数倍,这说明该菌可能通过释放内毒素来杀死叶状体细胞。鉴于此病是由于病原菌侵入叶状体并释放内毒素杀死紫菜细胞,且死亡细胞呈铁锈红色,故将其命名为“坛紫菜细菌性红烂病”。[中国水产科学,2008,15（2）：313—322]     

坛紫菜雌雄叶状体的细胞分化比较

以室内培养20～90 d的坛紫菜雌雄叶状体为研究材料,用酶解法分别获取单离细胞进行再生培养。在雌雄叶状体的体细胞再生体中,都出现9种不同发育类型。再生体发育类型的数目和比例与种藻日龄密切相关等结果,证实了离体培养的单离细胞发育成不同形态的再生体是基于其离体前处于不同分化时期所致;由壳孢子分化成性母细胞大致可划分成8个不同阶段。雌雄叶状体的细胞分化途经大致相同,但也有一定差异,雌性叶状体的细胞最终分化成雌性性母细胞,并产生大量的丝状体;而雄性叶状体的细胞最终分化成雄性性母细胞,绝大部分生成精子,但极少数产生丝状体。在雌雄叶状体的细胞再生体中,均产生 “类单孢子”并长成正常叶状体。雄性叶状体成熟较雌性早,与其细胞分化速度较快有关。成熟期不同的雌性品系观察结果表明,叶状体成熟越早、生长期越短,其体细胞分化速度也越快。     

琼胶寡糖诱导坛紫菜活性氧爆发

研究了琼胶寡糖诱导坛紫菜氧爆发的响应及其活性氧产生的位点。用琼胶寡糖诱导坛紫菜,以微呼吸测量系统检测坛紫菜氧消耗的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜的H2O2释放量;利用DCFH-DA染色观察活性氧在细胞上的定位;并利用实时定量PCR检测坛紫菜NADPH氧化酶基因Phrboh的差异表达;通过2-AMAC标记琼胶寡糖,观察其在坛紫菜的结合部位。结果显示,100μg/mL琼胶寡糖处理坛紫菜,出现两次呼吸爆发,分别在4min和10min左右,强度分别是基础呼吸的4倍和14.1倍;5min内出现H2O2的积累,15min达到峰值,比对照组高出近10倍。10μmol/LDPI可部分抑制H2O2的产生。3min内Phrboh的表达已上调,并持续近10min。DCFH-DA染色显示,活性氧主要产生在膜系统上。荧光标记琼胶寡糖的定位发现,坛紫菜细胞膜上存在琼胶寡糖的结合位点。综上所述,琼胶寡糖能识别细胞膜上的结合位点,并诱导坛紫菜膜系统上的H2O2爆发,H2O2的产生与NADPH氧化酶相关。     

坛紫菜优良品系的选育与特性分析

利用体细胞克隆技术,从象山湾采集回来的坛紫菜叶状体的体细胞再生群体中筛选出细长型生长快的叶状体,再次进行体细胞克隆,从它的体细胞再生体中再次选育出生长最快的叶状体,依此法连续筛选3次,最后获得一个快速生长的优良品系(XS-1),其F1代的叶状体在生长速度、成熟期、3种主要光合色素含量等方面明显优于野生型品系(wt)。在相同条件下培养80d,XS-1品系的F1代叶状体平均体长达128.8cm,是wt品系的10.45倍;XS-1品系的F1叶状体群体的成熟高峰出现时间比wt品系推迟20d;在波长350～750nm之间,两个品系的叶状体活体吸收光谱中均出现5个吸收峰,但XS-1品系的各峰峰值均远高于wt品系;XS-1品系的叶状体总藻胆蛋白含量高达80.4mg/g,比wt品系提高了188%,而它的Chl.a含量比wt品系提高了32%;XS-1品系的叶状体平均厚度为32.2μm,比wt品系减少15%。研究结果表明,XS-1品系是一个生长快、颜色和品质好、遗传稳定的优良品系,有望在生产中得到应用。     

条斑紫菜色彩突变体的诱导_分离和特性分析

条斑紫菜叶状体的原生质体经化学诱变剂－Ｎ－甲基－Ｎ’－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）处理后,在它们的再生叶状体中,出现了少量色彩发生变异的点状异体。它们的色彩变异细胞呈点状无规则地与野生细胞或其它变异细胞镶嵌在一起。这类变异体的单孢子萌发成单色变异（或野生色）叶状体以及与母体相似的点状变异体。利用单色变异叶状体分离出绿色（ｙｅｌ）,浅桔黄色（ｏｃｈ）以及深桔红色（ｂｕｓ）等三个突变株。突变株的叶状体活体吸收光谱以及藻红蛋白和藻蓝蛋白的含量与野生型相比均存在着明显的差异。经突变体支生型杂交实验证明,突变体ｙｅｌ和ｏｃｈ均含一个与色彩变化有关并且符合孟德尔遗传规律的隐性变异基因。相关变异基因的着丝粒距离,在突变体ｙｅｌ和ｃｏｈ中分别为１１．５和１５．８图距。     

坛紫菜“申福2号”的SSR分子标记

利用微卫星(SSR)分子标记技术, 对坛紫菜(Porphyra haitanensis)优良品系“申福2号”的丝状体和叶状体分别进行了特异性分子标记鉴定, 结果发现: 用9^#引物(序列为F: TCACAATGGGTGATATGGC; R: CCACAT TTAAGTCCGACTCTG) 对“申福2号”丝状体的DNA进行扩增, 出现了能区别于其他14个品系(6个优良品系, 3个杂交品系, 5个野生品系)的特异性条带。用该引物对室内培养的“申福2号”叶状体的DNA进行扩增, 也均获得了与丝状体相同的特异性条带。此外, 用该引物分别对栽培在不同海区和不同时期采收的“申福2号”叶状体进行验证, 结果均出现了与丝状体相同的特异性条带。该特异性条带的DNA测序结果证实, 9^#引物产生的SSR标记反映了微卫星DNA重复序列的变化。通过SSR Hunter软件搜索到了设计引物时的核心序列, 所得产物大小在预期长度范围内, 是特异性扩增。通过BLAST比对得知, 该序列在核酸数据库中没有同源序列, 是一个新序列。通过DNAMAN软件分析得知, “申福2号”、“申福1号”之间序列差异较小, 与坛紫菜霞浦野生种差异较大。这证实该标记反映的是种内品系间的差异, 可以用于种内品系鉴定。上述结果表明, 由9^#引物扩增出的这一特异性条带可以认为是“申福2号”丝状体和叶状体的特异性标记, 可用于该品系的种质鉴定。