漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LH β基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。     

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LHβ基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析.结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 kDa和8.55.GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成.序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同.半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41％-90.5 9％),其次为鲽形目、鲑形目和鲍形目(78.82％-85.88％),与鲤形目同源性最低(61.18％-71.76％).gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低.此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期).在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加.然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降.上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程.     

人工诱导花鳗鲡卵巢发育成熟及相关激素和组织的作用

采用多次肌肉注射黄体生成素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH-A2)和鲤脑垂体匀浆(carp pituitary extract,CPE)的方法诱导花鳗鲡卵巢发育成熟。在任意挑选的15尾实验组鱼中,5尾卵巢发育完全成熟,平均性腺系数(gonadosomatic index,GSI)为(20.9±5.04)%(最大达到27.3%);5尾卵巢发育至成熟期,平均GSI为(7.2±2.86)%;5尾卵巢发育至卵黄生成期,平均GSI为(2.32±1.5)%;而对照组的性腺停留在未发育的Ⅱ期[GSI为(1.18±0.39)%],这表明注射的激素能诱导雌性花鳗鲡性腺发育直到完全成熟。检测卵巢发育过程中脑垂体GtH的mRNA水平,血清中类固醇激素水平以及肝脏和消化道组织学变化。结果表明,脑垂体中GtHα、LHβ和FSHβ的mRNA水平随着卵巢的发育而逐渐增加,在卵巢发育成熟后下降,其中GtHα和LHβ的含量在卵巢发育成熟时虽比发育时期略有下降,但仍然呈现高表达量,而FSHβ在卵巢发育成熟时的表达量极低,几乎检测不到。血清雌二醇的含量在卵巢开始发育和卵黄生成期时的含量...     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析。结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长c DNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 k Da和8.55。GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成。序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同。半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41%–90.59%),其次为鲽形目、鲑形目和鲀形目(78.82%–85.88%),与鲤形目同源性最低(61.18%–71.76%)。gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低。此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期)。在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加。然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降。上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程。     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

拟穴青蟹3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与表达

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase,GAPDH)是维持生命最基本活动的关键酶之一.采用RT-PCR、RACE等技术,获得了拟穴青蟹gapdh基因全长cDNA序列.该序列全长1 440 bp,开放阅读框(ORF)为1 008 bp,编码335个氨基酸残基.同源分析显示,该基因编码的蛋白与其他一些物种具有很高相似性,推测gapdh基因具有很高的保守性.经荧光定量PCR检测,gapdh基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且在胸神经团、眼柄神经节、卵巢、表皮中表达量较高.在拟穴青蟹卵巢发育过程中,gapdh基因在卵巢发育早期(Ⅱ期)表达量最高,在卵巢发育成熟期(Ⅴ期)表达量最低,由此推测GAPDH主要参与了卵巢的细胞分裂增殖过程.     

军曹鱼dnd基因cDNA克隆及其在性腺周年发育过程中的表达

本研究通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum) dnd基因(Rcdnd)的cDNA序列,全长1339 bp,其中,5′非编码区59 bp,3′非编码区173 bp,开放阅读框(ORF) 1107 bp,共编码368个氨基酸。Rcdnd氨基酸序列含有1段RNA识别保守基序(RRM)以及4个C端保守结构域(CR1~4),与高体 (Seriola dumerili) dnd的一致性最高(72.3%)。系统进化分析表明,Rcdnd与高体 的同源蛋白亲缘关系最接近。基于半定量RT-PCR的组织表达分布分析结果显示,Rcdnd在性腺中特异表达,在其他组织中均无表达。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,在精巢发育过程(Ⅱ~Ⅴ期),Rcdnd的表达水平呈逐渐上升趋势;在卵巢发育过程(Ⅰ~Ⅲ期),Rcdnd的表达水平先显著升高后趋于稳定,在150 dph (Ⅱ期)时的表达量最高。原位杂交结果显示,不同发育时期性腺组织中,Rcdnd mRNA主要在生殖细胞中表达。在精巢中,Rcdnd mRNA集中表达于精原细胞和初级精母细胞的周缘,次级精母细胞中的杂交信号明显减弱,而精细胞和成熟精子中几乎检测不到杂交信号。在卵巢中,Rcdnd mRNA在卵原细胞中的表达最强,在初级卵母细胞中的表达较弱,其中,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ时相卵母细胞检测到的杂交信号强度无显著差异,且杂交信号均匀分布于细胞质中。研究结果表明,Rcdnd基因可能参与军曹鱼性腺发育过程,上述结果可为揭示军曹鱼两性生殖细胞发生发育的调控机理提供理论依据。     

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。     

鳜三种生长抑素cDNA全长克隆、组织表达及其在脑中定位分析

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜脑中3种生长抑素前体(preprosomatostatin,PSSⅠ、PSSⅡ和PSSⅢ)cDNA全长序列。结果显示,鳜PSSⅠcDNA全长647 bp,含开放阅读框369 bp,共编码122个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽,C端SS-14在脊椎动物中非常保守;PSSⅡcDNA全长655 bp,开放阅读框387 bp,编码128个氨基酸,前25个氨基酸为信号肽,C端带有[Tyr7,Gly10]SS-14;PSSⅢcDNA全长823 bp,开放阅读框333 bp,共编码110个氨基酸,前21个氨基酸为信号肽,C端带有[Pro2]SS-14。利用RT-PCR检测了鳜PSS mRNA的组织表达特征,3种PSS mRNA均在脑中表达,PSSⅠmRNA在其他组织中未检测到表达,PSSⅡmRNA在食道和胃中大量表达,PSSⅢmRNA在肾和性腺中大量表达。推测3种PSS除一致参与神经调控外,PSSⅡ还可参与消化作用调控,PSSⅢ参与调控生殖作用。脑组织原位杂交分析表明,PSSⅠmRNA在下丘脑和延脑中表达,PSSⅡmRNA在下丘脑中表达,PSSⅢmRNA在下丘脑、视觉盖、延脑和脊髓中表达。3种PSS均在下丘脑中表达,表明它们可能参与腺垂体激素分泌的调节;在其他脑区存在表达差异,推测它们还可作为神经递质或调节因子,发挥不同的生物学效应。