湖北省潜江地区克氏原螯虾白斑综合征PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒(WSSV)已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%(15/27),未检测到斑节对虾杆状病毒(MBV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV);检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株(KR083866.1)核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡(累积死亡率为100%),并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

白斑综合征病毒感染克氏原螯虾后的PCR检测及组织病理学研究

采用投喂感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)对虾肌肉的方式,对养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)进行人工感染,以确定WSSV对养殖克氏原螯虾的易感性。结果发现,投喂病虾感染组螯虾的死亡率达到90%,而对照组未出现死亡。采用PCR对试验组螯虾的肌肉进行WSSV检测,发现投喂感染组的阳性检出率为100%,对照组的阳性检出率均为0。PCR检测结果发现,濒死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织的PCR结果均为WSSV阳性,而对照组的各组织检测结果均为阴性。组织切片的光镜观察也证实,濒死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏及血淋巴等组织均发生了不同程度的病变。     

湖北省潜江地区克氏原螯虾(procambarus clarkii)白斑综合征(White Spot Syndrome)PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒（WSSV）已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%（15/27）,未检测到斑节对虾杆状病毒（MBV）和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）;检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株（KR083866.1）核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡（累积死亡率为100%）,并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

白斑综合征病毒(WSSV)在市售克氏原螯虾中携带情况调查

近年来白斑综合征成为制约克氏原螯虾养殖的重要病害。对市场销售的克氏原螯虾抽样调查,采用PCR仪检测白斑综合征病毒(WSSV)的携带情况,结果为:湖泊养殖的克氏原螯虾不携带WSSV,池塘单养的克氏原螯虾及江河野生克氏原螯虾携带WSSV。     

克氏原螯虾自噬相关基因PcAtg2的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析

为了解自噬相关基因Atg2在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用,本研究克隆了克氏原螯虾Atg2 (PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示,PcAtg2蛋白编码序列全长为9 966 bp,推测其编码2 189个氨基酸。组织定量表达分布显示,PcAtg2在克氏原螯虾的各个组织中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中,PcAtg2基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA干扰(RNAi)实验显示,PcAtg2基因沉默后,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制,同时,自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示,在WSSV感染后,PcAtg2基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对WSSV胁迫下的调控机制提供理论参考。     

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

白斑综合征病毒(WSSV)对不同规格克氏原螯虾(Procambarus clarkii)致病力及ATPase活性的影响

以投喂患白斑综合征病毒病(WSSV)的南美白对虾组织的方法人工感染健康的克氏原螯虾,利用PCR检测实验克氏原螯虾的感染情况;同时比较健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内ATPase活性.结果显示:白斑综合征病毒可以感染克氏原螯虾,受感染的克氏原螯虾体内病毒含量与其死亡呈正相关;健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内的ATPase活性分别为7.337 U/mgprot和4.212 U/mgprot,有极其显著的差异.     

克氏原螯虾细胞色素c基因通过调节凋亡途径抑制WSSV感染

细胞凋亡是由一系列相关基因严格调控的细胞程序性死亡,在抵御病原入侵、维持机体内环境稳态等方面有着重要意义。其中细胞色素c从线粒体释放到细胞质中是凋亡开始的关键一步。本研究利用RACE技术首次克隆获得了克氏原螯虾(Procambarus clarkii)细胞色素c基因(PcCytc),全长为897 bp,包括163 bp的5′-UTR、419 bp的3′-UTR和315 bp的开放阅读框,编码104个氨基酸。定量PCR检测结果显示,PcCytc基因在克氏原螯虾的各组织中均有表达,其中在鳃、肠道和肌肉中表达高,在胃中表达最低。WSSV感染实验显示,在病毒感染后PcCytc在肝胰腺、肠道和肌肉组织中的表达水平均出现上调,并在24 h达最高值,约是此时PBS组表达量的2.65、2.07和2.20倍,均存在极显著性差异(P<0.01)。PcCytc基因干扰后,克氏原螯虾体内WSSV病毒拷贝数显著增加(P<0.05),表明PcCytc能够抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制,延迟感染;同时,凋亡相关基因bcl-2、bax和caspase-3的表达均发生显著上调或下调(P<0.05)。本研究表明,PcCytc可通过调节凋亡途径抑制WSSV感染,为克氏原螯虾对WSSV感染的免疫反应提供了新的见解。     

WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响

分析了克氏原螯虾Procambarus clarkia人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)后,其血细胞吞噬(Phagocytosis)活性,肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化规律,其目的是为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据.分析结果显示,随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性、肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律性比较明显,可作为WSSV感染的敏感指标,也可以用作间接指示克氏原螯虾健康状况的指标.而在不同的感染时间,克氏原螯虾肝胰腺ACP与AKP的活性波动较大,无明显的规律可循,难以作为WSSV感染的敏感指标.     

注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在0~72 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克氏原螯虾PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。     

饲料蛋白质水平和加工工艺对克氏原螯虾生长性能、消化力和抗氧化性能的影响

为研究不同蛋白质水平和加工工艺饲料对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长性能、消化力和抗氧化能力的影响，本研究采用4个蛋白质水平(28%、30%、32%和36%)和2种加工工艺即膨化饲料(EF)和硬颗粒饲料(PF)的4×2双因素实验设计，进行为期13周的养殖实验。结果显示，蛋白质水平和加工工艺对克氏原螯虾增重率和肝体比有显著的交互作用(P<0.05)。主效应结果显示，28%蛋白质可显著提高增重率和特定生长率，EF组的末重和增重率显著高于PF组(P<0.05)。蛋白质水平和加工工艺对肝胰脏的胰蛋白酶和淀粉酶活性有交互作用(P<0.05)。主效应结果显示，肝胰脏的胰蛋白酶、淀粉酶和肠道胰蛋白酶、淀粉酶均在28%蛋白质水平时最高，EF组肝胰脏胰蛋白酶、淀粉酶和肠道胰蛋白酶活力高于PF组(P<0.05)。蛋白质水平和加工工艺对肝胰脏的丙二醛和碱性磷酸酶活性有显著的交互作用(P<0.05)。主效应结果显示，肝胰脏碱性磷酸酶活性以及血清的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶均在28%蛋白质水平时最低。PF组肝胰脏丙二醛含量显著低于EF组(P<0.05)，碱性磷酸酶活性显著低于EF组(P<0.05)。4种模型(Logistic、Gompertz、Von Bertalanffy和Brody)均能很好地模拟克氏原螯虾体重和体长的生长曲线，拟合度均大于0.97，其中，以Logistic模型拟合克氏原螯虾体重和体长最优，且幂函数可以反映体重和体长之间的关系。综上所述，28%蛋白质水平和膨化加工工艺使克氏原螯虾具有最优的生长性能和消化力，28%蛋白质水平的硬颗粒饲料可提高克氏原螯虾的抗氧化能力。     

Quantitative real time PCR for the measurement of white spot syndrome virus in shrimp

Quantitative real time PCR, recently developed in molecular biology, is applied in this paper to quantify the white spot syndrome virus (WSSV) in infected shrimp tissue. The WSSV content in moribund shrimp of all species tested ( Penaeus stylirostris, P. monodon, P. vannamei ) ranged from 2.0 × 10⁴ to 9.0 × 10¹⁰ WSSV copies μg^–1 of total DNA ( n =26). In whole moribund post-larvae, 4.3 × 10⁹ WSSV copies μg^–1 of DNA were detected which is equivalent to 5.7 × 10¹⁰ WSSV copies g^–1 of post-larvae. The comparison of WSSV content between different tissues showed that muscle and hepatopancreas tissues contained 10 times less virus than gills, pleopods and haemolymph. With inocula of known virus content, bioassays by immersion challenge showed that a minimum of five logs of WSSV copies was necessary to establish disease in the challenged shrimp. In contrast, five logs of WSSV copies injected into shrimp muscle produced a LT-50 of 52 h. This real time polymerase chain reaction (PCR) technique is sensitive (four copies), specific (negative with DNA from shrimp baculoviruses and parvoviruses), dynamic (seven logs) and easy to perform (96 tests in <4 h).     

Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus

White spot syndrome virus (WSSV) is one of the most important pathogens of penaeid shrimp. It is widely distributed in most Asian countries where penaeid shrimp are cultured, as well as in the Gulf of Mexico and SE USA. The virulence of six geographic isolates of WSSV was compared using Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles. The six geographic isolates of WSSV originated from China, India, Thailand, Texas, South Carolina, as well as from crayfish maintained at the USA National Zoo. For challenge studies, virus infected tissues were given per os to L. vannamei postlarvae and Fa. duorarum juveniles. Resultant WSSV infections were confirmed by histological examination. The cumulative mortality of L. vannamei postlarvae reached 100% after challenge with each of the six geographic isolates of WSSV. However, the Texas isolate caused mortalities more rapidly than did the other shrimp isolates; the crayfish WSSV isolate was the slowest. In marked contrast, cumulative mortalities of juvenile Fa. duorarum reached only 35–60%, and varied among the geographic isolates of WSSV. Interestingly, in Fa. duorarum, the Texas WSSV isolate was also the most virulent, while the crayfish WSSV was the least virulent. The findings suggest that slight differences in virulence exist among geographic isolates of WSSV, and that susceptibility may vary with species and lifestages of the host.     

克氏原螯虾PcCyc基因克隆及其对光周期的表达响应

利用cDNA末端快速扩增技术克隆克氏原螯虾生物钟核心基因之一的周期循环蛋白(CYC)基因(命名为PcCyc基因)的部分cDNA序列。取雄性克氏原螯虾(体长9~11 cm)在全光谱日光灯不同光周期下(12L∶12D、0L∶24D和0L∶72D)培养结束后,于7:00、11:00、15:00、19:00、23:00、翌日03:00、7:00取样,采用实时荧光定量PCR检测PcCyc基因在脑、眼柄和肝胰腺中的mRNA表达水平。试验结果显示,PcCyc基因完整的开放阅读框共2010个碱基,可编码669个氨基酸。氨基酸序列与红螯螯虾CYC蛋白相似性为94%;蛋白分子量约73.963 ku,理论等电点6.56,为疏水性非分泌蛋白,无信号肽;结构域分析结果显示,PcCYC蛋白含有BHLH/PAS结构域,包括1个HLH结构域和2个PAS结构域;二级结构包含11个α-螺旋、12个β-折叠和24个无规则卷曲。不论光照如何改变,PcCyc基因在眼柄和肝胰腺中都基本遵循着24 h的节律振荡,而在大脑中的节律振荡随光照周期改变被打破。试验结果将为进一步探究克氏原螯虾Cyc基因在其昼夜生物钟节律中发挥的作用及机制奠定基础。     

蛋白质水平及能量蛋白比对克氏原螯虾生长与蛋白酶活力的影响

用3种不同蛋白质水平及能量蛋白比(E/P)水平饲料投喂克氏原螯虾,分析比较不同饲料对克氏原螯虾生长及蛋白酶活力的影响.试验结果表明,当饲料蛋白质水平为31.86%、E/P为35.85 kJ/g时,克氏原螯虾生长最快.随着饲料蛋白质含的上升, 克氏原螯虾肠蛋白酶活力无显著变化(P＞0.05),肝胰脏、胃蛋白酶活力显著增强(P＜0.05);饲料E/P水平未引起胃、肠、肝胰脏蛋白酶活力的显著变化(P＞0.05),当饲料蛋白质水平为31.47%、E/P为40.42 kJ/g时,克氏原螯虾蛋白酶活力最高.     

池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肌肉和肝脏营养成分比较

通过对池塘和稻田2种养殖模式下克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的肌肉常规营养成分进行测定,同时,对肌肉和肝胰腺的氨基酸和脂肪酸组成进行测定,从而对其营养品质进行分析评价。结果显示,2种养殖模式下克氏原螯虾粗蛋白和粗脂肪无显著性差异(P>0.05),池塘养殖模式下水分显著高于稻田模式(P<0.05),而粗灰分显著低于稻田模式(P<0.05)。在2种模式下肌肉和肝胰腺中均检测出17种氨基酸,包括7种必需氨基酸和4种鲜味氨基酸。2种养殖模式下肌肉的必需氨基酸总含量占氨基酸总量(WEAA/WTAA)值无显著性差异(P>0.05),而肝胰腺中池塘养殖模式WEAA/WTAA值显著高于稻田模式(P<0.05)。根据氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS),克氏原螯虾肌肉和肝胰腺中第一限制氨基酸均为甲硫氨酸＋胱氨酸,肌肉中第二限制氨基酸为缬氨酸,肝胰腺中第二限制氨基酸为亮氨酸。另外,在肌肉中检测出20种脂肪酸,而在肝胰腺中检测出24种脂肪酸,其中,肌肉和肝胰腺中饱和脂肪酸含量最高的是棕榈酸(C16:0);单不饱和脂肪酸含量最高的是油酸(C18:1n9c)。研究表明,池塘和稻田2种养殖模式下的克氏原螯虾,肌肉和肝胰腺均具有较高的食用价值和营养价值。