鱼类抗刺激隐核虫感染的黏膜免疫研究进展

刺激隐核虫是一种原生纤毛类寄生虫,可以感染几乎所有海水硬骨鱼类并导致死亡,给海水鱼类养殖业造成巨大经济损失。由于刺激隐核虫体表寄生的特性,使其成为研究鱼类黏膜免疫机制的良好病原模型,可为高效疫苗的研发提供理论依据。本文综述了鱼类抗刺激隐核虫感染的黏膜免疫研究进展,以期为开展海水鱼类抗刺激隐核虫感染的免疫防控措施研究提供理论支撑。已有研究表明,受刺激隐核虫感染后,斜带石斑鱼皮肤黏液或其培养上清液能使幼虫发生阻动,由皮肤中的抗体分泌细胞产生的特异性IgM抗体在抗寄生虫感染中发挥重要作用;同时在刺激隐核虫感染时,多种免疫细胞如NCC细胞、中性粒细胞等在寄生虫周围聚集,趋化因子以及趋化因子受体表达量在寄生虫感染部位上调,暗示其调节的免疫细胞也参与抗虫免疫;此外,研究发现黄斑蓝子鱼对刺激隐核虫具有天然抗性,其血清和皮肤黏液对刺激隐核虫幼虫和滋养体均具有杀灭作用,已从其血清中分离到一种天然抗虫蛋白—L-氨基酸氧化酶,为刺激隐核虫病的防控提供新的途径;在理论研究的基础上,通过免疫实验证实疫苗防控刺激隐核虫病是可行的。     

感染刺激隐核虫的大黄鱼对低溶氧量的耐受力研究

每年6月中下旬至7月初是福建省沿海养殖的大黄鱼刺激隐核虫病的发病高峰期,为明确患病大黄鱼暴发性死亡的原因,进行了患刺激隐核虫病大黄鱼对低溶氧量的耐受力试验。结果表明,病情越严重的鱼出现浮头、大量死亡时的溶氧量越高、耗氧率越低。健康鱼的窒息点和耗氧率分别为2．58mg／L、332．4mg／kg·h^-1,而病情呈“＋＋＋”鱼的窒息点和耗氧率分别为3．83mg／L、196．0mg／kg·h^-1。结合试验结果和养殖生产的实际情况,笔者认为患刺激隐核虫病的大黄鱼对低溶氧量的耐受力降低,易导致其暴发性大量死亡。     

大黄鱼刺激隐核虫病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测分析

由刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染引发的"白点病"为大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖业带来重大损失,但仍未找到安全、有效的治疗方法。本研究应用免疫组织化学方法,对健康大黄鱼和患刺激隐核虫病大黄鱼肠、脾、头肾与肝组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)蛋白进行检测,研究刺激隐核虫病大黄鱼组织中MIF的表达情况及其对预后的影响。结果表明,MIF在健康大黄鱼肠、脾、头肾、肝各组织中均无表达;MIF在刺激隐核虫病大黄鱼各组织中高表达,表达强度从弱到强依次是肠、肝、脾、头肾,MIF表达阳性率分别为54%、80%、86%、90%。推测MIF在大黄鱼刺激隐核虫病发病过程中发挥作用。     

大黄鱼刺激隐核虫病继发细菌感染致死原因的研究

为明确大黄鱼刺激隐虫病大量死亡的致死原因,从患刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）病的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）肝脏中分离细菌,病情程度较轻的鱼未分离到细菌,非常严重的鱼分离到细菌;分离的菌株经纯化后鉴定为创伤弧菌（Vibrio vulnificus）,利用纯化后的菌株作回归感染试验,其感染率为100%,死亡率为80%。研究表明患刺激隐核虫病的大黄鱼体内的细菌为继发性感染,是导致大黄鱼大量死亡的致病菌,其感染途径为水→伤口→体内。     

刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响

刺激隐核虫感染能够导致海水鱼类感染“白点病”,而大黄鱼是受“白点病”影响最严重的海水养殖鱼类。为了探究刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响,本研究利用刺激隐核虫人工感染大黄鱼,分别在感染后0、12、24、48和72 h采集血液、肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织,并检测血清皮质酮、皮质醇以及肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等指标的变化。同时使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织中TNF-α、IL-8和IL-1β基因的表达量。结果显示,在大黄鱼感染刺激隐核虫后的0~72 h内,实验组大黄鱼表现出刺激隐核虫病的发病症状;血清皮质醇和皮质酮含量显著增加;肝脏GSH-Px活性极显著降低;肝脏SOD活性极显著增加;肝脏MDA含量在0~12 h内急剧增加并达到峰值,随后含量缓慢降低;各组织中的TNF-α、IL-8和IL-1β的表达量均有不同程度的上调,在鳃、头肾、肝脏和皮肤中上调最为显著。研究表明,刺激隐核虫感染后有明显变化的皮质类激素含量和氧化应激指标能够反映大黄鱼的感染程度,有助于进一步辅助抗虫表型测量的优化。     

人工感染的刺激隐核虫各期虫体的超微结构

从天然感染的卵圆鲳鲹（Trachiruotus blochii）分离到1株刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）,再经人工感染的方法收集各期虫体,制成电镜样品,对虫体进行超微结构研究。刺激隐核虫质膜的基本结构与淡水的多子小瓜虫的质膜相似,分为3层;外限制膜、外胞膜和内胞膜。刺激隐核虫的质膜小泡内充满大量电子致密物质（EDM）。幼虫、幼体和滋养体均具有复杂的口器,由胞咽、口肋、双动基体口纤毛和线带等组成,但不具备膜口类纤毛虫所具有的独特的细胞器：Lieberkuhn氏器。单动基体的体纤毛存在于幼虫、幼体和滋养体,但在包囊期,体纤毛和口器消失。各期虫体的胞质中具有线粒体、高尔基体和脂肪体等细胞器,有的阶段具有粘液囊、伸缩泡、食物泡、共生细菌等。粘液囊在大小、形态和分布上与多子小瓜虫的不同。文中分析了刺激隐核虫在形态上与多子小瓜虫的诸多差异,认为刺激隐核虫的分类更适合归于原口类（Promotome）,而不是膜口类（Ophryoglenina）。     

刺激隐核虫小GTP酶Ran基因的克隆与表达

对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的小GTP酶Ran基因(Ci Ran)进行研究,以期为刺激隐核虫病原生物学研究及其防治提供理论基础。从刺激隐核虫滋养体/包囊前期cDNA文库中筛选出Ci Ran基因的克隆,利用生物信息学方法对CiRan基因及其编码的蛋白进行结构与功能的预测;通过逆转录PCR检测CiRan的mRNA。结果表明其在刺激隐核虫的各个发育阶段均有表达。对CiRan基因开放阅读框内的非通用密码子进行改造,并构建重组质粒p GEX-4T-1/CiRan,将其转化到大肠杆菌(E.coli)后成功表达分子量为51.3 kD的重组融合蛋白rCiRan。用rCiRan蛋白免疫鼠血清进行免疫印迹分析,结果表明,抗rCiRan血清能识别刺激隐核虫各期虫体的天然CiRan蛋白,其表观分子量为25.3 kD,与根据编码基因序列推测出的理论值相符;以rCiRan的抗血清做间接免疫荧光抗体实验,结果表明天然CiRan蛋白在幼虫的细胞质和细胞核内均有分布,且在核膜周围富集,佐证了该分子潜在的功能。     

刺激隐核虫钙调蛋白基因的分子鉴定

为了解钙调蛋白在刺激隐核虫生长发育过程中的作用,实验从刺激隐核虫滋养体cDNA 文库中克隆出钙调蛋白基因 （cicam）,优化密码子后人工合成开放阅读框 （ORF）,构建成重组质粒 pGEX-4T-1/cicam,将其转化至大肠杆菌后,通过 ZYM-5052 自诱导培养基诱导重组子表达。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶及凝血酶纯化重组蛋白 rCiCaM,并用其免疫小鼠 BALB/c 株获得多克隆抗体。分别用逆转录 PCR 和免疫印迹实验检测 cicam 及其编码蛋白 CiCaM 在各期虫体中的表达。通过间接荧光抗体实验检测 CiCaM 在幼虫中的定位。通过覆盖印迹实验 （Blot overlay assay） 初步探讨了重组蛋白 rCiCaM 结合重组肌动蛋白解聚因子的活性。结果显示,cicam 的 ORF 为 450 bp,编码含 149 个氨基酸的肽链,其分子量预测值为 16.9 ku;原核表达的融合蛋白 GST-rCiCaM 及切除 GST 标签的 rCiCaM 的表观分子量分别为 43 和 16.9 ku,均与预测值相符;cicam 在刺激隐核虫的各个发育阶段都有稳定的表达,其表达产物 C...     

福建省主要养殖区海水网箱养殖鱼类刺激隐核虫病的调查及防控对策

调查了2007、2008年福建省主要养殖区海水网箱养殖鱼类危害最大的寄生虫疾病--刺激隐核虫病的流行情况,分析病因并提出了防控对策.     

患刺激隐核虫病的真鲷感染迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定

2012年8月,福清市东瀚海区网箱养殖真鲷发生大量死亡事件.病鱼除刺激隐核虫病症状外,还出现脾、肾肿大,肝脏充血等.采用生理生化指标鉴定及16S rDNA系列同源性分析和系统发育树构建等方法,对从病鱼肝脏分离获得的优势菌株进行了鉴定,其生理生化指标符合迟钝爱德华氏菌特点,GenBank中同源序列比对结果显示,该菌与迟钝爱德华氏菌的16S rDNA序列同源性高达99％,系统进化树中与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支.药敏实验结果表明,该菌对氟苯尼考等10种药物敏感,对链霉素等4种药物中等敏感.     

福建省夏季网箱养殖鱼类主要病害情况及对策

研究了6种中草药水提取物对刺激隐核虫(Crytocaryon irritans)的体外杀灭效果,发现用7.14 mg·mL^–1的乌梅(Fructus mume)、槟榔(Areca catechu)、贯众(Dryopteris setosa)和石榴皮(Punica granatum)的水提取物分别处理幼虫5 min,幼虫死亡率达100%,用28.57 mg·mL^–1处理包囊4 h,包囊死亡率达84.1%以上。为评估喂服乌梅水提物对珍珠石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♀×E.fuscoguttatus♂)预防刺激隐核虫病的效果,投喂第14天后对石斑鱼的增重、溶菌酶活性、补体旁路途径溶血活性和鱼体滋养体数量及死亡率进行测试和评估。结果显示,药物组石斑鱼的增重和旁路补体溶血活性与对照组没有显著性差异(P>0.05),溶菌酶活性均显著高于对照组(P<0.05),感染刺激隐核虫后滋养体数量均显著低于对照组(P<0.05);致死剂量攻毒后,药物组(11.4 g·kg^–1、6.84 g·kg^–1、3.42 g·kg^–1)和对照组鱼的成活率分别为40%、20%、46.67%和0%。结果表明乌梅对预防刺激隐核虫病具有一定的开发前景。     

在体条件下miR-305-5p对日本沼虾MnCHT3A的靶向调控作用

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。