对虾白斑综合症病毒的分子生物学研究进展

对虾白斑综合症病毒(wkite spot syndrome virus,WSSV)又称对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus WSBV),是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。自1992年以来,各国学者对WSSV进行研究。由于他们研究的方法及研究的侧重点不同,对该病毒命名各异。陈秀男(1993)称之为白斑综合症杆状病毒(WSBV);荷兰Wongteerasupaya(1995)称其为系统外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV);     

对虾白斑综合症（WSS）的分子流行病学研究进展

本文主要依据1993年以来关于白斑综合症(WSS)的研究结果,对白斑综合症的致病因子与暴露、生物标志与生物学效应、易感性、预防策略进行综合评述,以期为有效控制WSS疫情、重振对虾养殖业提供参考。     

白斑综合症病毒（WSSV）在对虾养殖过程中传播途径的调查

为探讨人工养殖条件下池塘中对虾是如何感染暴发性流行病,作者通过对人工养殖对虾暴发白斑综合症的池塘进行生物调查和取样,经ＰＣＲ检测,获得了一些有意义的结果。发现：在暴发白斑病的池塘中,中国对虾和日本对虾以及池中的脊尾白均可检测到阳性,阳性率大小与发病的程度有关;蟹类未检测到阳性个体;鱼类和底栖的沙蚕亦未检测到阳怕;浮游动物的糠虾类未检测到阳性;桡足类检测为阳性,说明桡足类是对虾白斑病毒中宿主之一,由携带病毒的桡足类水平传播给对虾等以此为饵的甲壳类动物。     

感染白斑综合症病毒（WSSV）对虾相关免疫因子的研究

129尾中国对虾（Penaeus chinensis）分别捕自未暴发白斑综合症（WSSV病毒所致）虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒（WSSV）程度。用96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力（Ua）、溶菌活力（U↓（L））、酚氧化     

利用试剂盒检测对虾白斑综合症病毒

对虾白斑综合症病毒(wssv),又称对虾杆状病毒或皮下造血组织坏死杆状病毒,是迄今为止危害对虾养殖最为严重的一种病害.发病期一般在幼体期到生长期,死亡率可达100%,该病毒的流行给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失,成为对虾养殖业可持续发展的主要障碍之一.     

斑节对虾白斑综合症病毒部分基因组文库及核酸探针检测法

通过分离纯化白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）粒子,抽提病毒ＤＮＡ。用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ或ＳａｌⅠ酶切后,克隆入质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ中,从而建立了ＷＳＳＶ部分基因组文库。估计ＷＳＳＶ基因组ＤＮＡ在１６５ｋｂ以上。将ＷＳＳＶ ＥｃｏＲⅠ克隆片段标记制备为探针。进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、打点杂交和原位杂交,其结果证明了克隆片段对ＷＳＳＶ特异,并为检测ＷＳＳＶ提供了方法。通过对部分基因组文库序列     

白斑综合症病毒（WSSV）对中国对虾卵及各期幼体人工感染的试验研究

用感染白斑综合症毒病的中国对虾头胸甲，对健康的仔虾进行了人工投喂感染实验，同时从病虾中分离出病毒悬液作为毒种，无节幼体，蚤体 幼体和糠虾体进行不同温度条件下的人工浸浴实验，结果表明，卵和无节幼体，蚤状幼体，糠虾幼对病毒悬液不敏感,闰理切片观察未见病毒粒子，光镜病理切片可观空到鳃上皮，前肠上皮有包涵体样病变，同时在肝胰组织中发现了肝胰腺细小病毒（HPV）包涵体。     

中国对虾抗病性状遗传标记筛选及遗传多样性分析

对人工选育的29个中国对虾半同胞家系进行人工感染WSSV后,选取存活时间最长和存活时间最短各29个个体,组成抗病群体和感病群体。用400个随机引物进行RAPD分析,得到与抗病正相关的特异性遗传标记5个,与抗病负相关的特异性遗传标记两个。15个随机引物在两个群体的扩增位点进行统计,共得到82个位点,其中多态位点34个,占41.46%,两个群体的多态位点比例分别为40.24%和37.8%。Shannon′s多样性指数估算两个群体的平均遗传多态度为0.2177,SLT群体的遗传多态度为0.2190略高于SST群体0.2163;群体内的遗传变异（HPOP/HSP）0.9645,可见96.45%的遗传变异来自于群体内,3.55%的变异来源于群体间。统计各座位的基因频率计算出两个群体的遗传分化指数为0.0294,表明两个群体并没有发生明显的遗传分化。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3与WSSV的体外相互作用

Tetraspanin-3是四跨膜蛋白超家族的一员,在信号转导和免疫等过程中起到重要作用。本研究将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3 (FcT3)的大胞外环区(Large extracellular loop, LEL)基因片段克隆,与原核表达载体pBAD/gⅢA连接,获得重组表达载体pBAD/gⅢA-T3L,转化入大肠杆菌TOP 10中,用L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导并经钴离子亲和层析纯化得到重组蛋白。质谱分析显示,纯化的重组蛋白为FcT3。用地高辛将FcT3L标记并与WSSV作用,Far-western分析显示,FcT3L与VP26结合。ELISA实验结果显示,FcT3L与VP26蛋白的相互作用随VP26量的增加而增强。推测FcT3通过与VP26作用介导病毒核衣壳的入胞过程。     

中国对虾雄性生殖系统感染WSSV在其垂直传播中的作用

通过人工感染实验,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)雄性亲虾进行投喂感染。在确定其携带WSSV粒子后,将被WSSV感染的精荚人工移植到健康的雌虾纳精囊内。在无其他病源的情况下,促其产卵繁殖,统计各组子代的受精率、孵化率及无节幼体至溞状幼体的变态率贸?式PCR技术对亲虾及子代进行WSSV检测。结果表明,受WSSV感染的精荚能够把病毒传播给健康雌虾,雌虾能产出携带WSSV的卵子,培育出带毒幼体。各组子代的受精率、孵化率及变态率的统计结果表明,感染组和对照组在受精率上没有明显区别,受WSSV感染的精卵细胞可以正常结合。对照组受精卵的孵化率明显高于感染组,差异显著(P=0.045<0.05)。对照组无节幼体的变态率也高于感染组。说明WSSV的入侵对受精卵及幼体的发育有影响,WSSV感染导致部分受精卵及幼体不能正常发育或死亡。     

Three tetraspanins from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis, may play important roles in WSSV infection

Three members of the tetraspanin/TM₄SF superfamily were cloned from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis . The deduced amino acid sequences of the three proteins have typical motifs of the tetraspanin/TM₄SF superfamily. Phylogenetic analysis of the proteins, together with the known tetraspanins of invertebrates and vertebrates, revealed that they belong to different tetraspanin subfamilies: CD9, CD63 and tetraspanin-3. The three cloned genes of CD9, CD63 and tetraspanin-3 showed apparently different tissue distributions. The CD9 gene ( FcCD9 ) was specifically expressed in the hepatopancreas. While for the CD63 gene ( FcCD63 ), the highest expression was detected in nerves, epidermis and heart, with low expression in haemocytes, ovary, gill, hepatopancreas and stomach and no expression in intestine, muscle and lymphoid organ. Compared with FcCD9 and FcCD63 , the tetraspanin-3 gene ( FcTetraspanin-3 ) was more broadly expressed and its highest expression was detected in the intestine. Its expression in nerves was lower than in the intestine, but was higher than in other tissues. Expression in haemocytes, ovary and muscle was much lower than in other tissues. The expression profiles of FcCD9 , FcCD63 and FcTetraspanin-3 in different tissues, including haemocytes, lymphoid organ and hepatopancreas, were compared by real-time PCR when shrimp were challenged by live white spot syndrome virus (WSSV) and heat-inactivated WSSV. All three tetraspanins were markedly up-regulated in the live WSSV-challenged shrimp tissues. The data suggested that the three cloned members of TM₄SF superfamily in Chinese shrimp may play a key role in the route of WSSV infection.     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡,是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测,旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％;渤海湾群体35％;辽东湾群体94．7％;海州湾群体47．4％。结果显示,中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体,推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的,笔者认为,只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时,应该重视海区污染的治理,减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法,1pg病毒核酸仍可检测到,为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

人工选育中国对虾两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化

通过分析中国对虾人工选育两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化，研究选育的两个中国对虾群体对WSSV的敏感性和抵抗力。结果表明，两个群体感染WSSV后，总细胞数（THC）在24h达到最大，随后呈下降趋势；两个群体血淋巴蛋白在感染初期和中期变化不同，但在后期均呈下降趋势；相比而言2＇对虾群体比6＇对虾群体血蛋白含量和THC下降幅度稍慢；2＇对虾群体和6＇对虾群体感染24h后酸性磷酸酶（ACP）稍有下降，随后保持较高的活性，而碱性磷酸酶（AKP）的变化除2＇对虾群体在感染48h有显著增大外，6＇对虾群体变化不明显；过氧化氢酶（CAT）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）与WSSV感染有密切的联系，两个群体抗氧化酶活性随WSSV增殖的变化略有不同；细胞内酚氧化酶（proPO）原变化趋势也表现出差异，斑点杂交结果显示6＇对虾群体比2＇对虾群体阳性反应较早，揭示不同群体间对WSSV感染的敏感性存在一些差异。     

感染白斑综合症病毒中国对虾雄性生殖系统的PCR检测与电镜观察

通过人工投喂携带WSSV的毒饵，对性腺发育成熟的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）雄虾（♂）进行感染实验。采用nest-PCR（巢式PCR）技术，检测感染后的中国对虾雄性生殖系统受WSSV感染情况，同时选取感染严重的虾样进行电镜观察。巢式PCR检测结果表明，感染组中国对虾的精巢、输精管和精囊均被WSSV感染，其中精囊呈阳性的最多，输精管次之，精巢最少。通过电镜进一步观察发现，WSSV粒子只存在于精巢、输精管和精囊的结缔组织中，而在其他组织和生殖细胞中均未发现病毒粒子。其中，精巢中WSSV粒子存在于精巢内两个生精小管之间的结缔组织；输精管中WSSV粒子存在于管壁的结缔组织；精囊中WSSV粒子也只存在于精囊内膜的结缔组织和精荚膜的结缔组织中。PCR检测和电镜观察结果均表明，WSSV粒子能感染中国对虾的雄性生殖系统且对性腺感染存在着一定的组织特异性。     

微卫星DNA标记用于中国对虾亲子关系的鉴定

在水产养殖中应用微卫星标记来确定亲缘关系已经得到认同和广泛使用。本研究通过控制交尾,利用微卫星标记确定中国对虾后代的亲缘关系,对微卫星标记应用于中国对虾的家系识别进行初步探讨。作者以4个谱系清晰的家系为基础,检测两对微卫星标记EN0033和RS062在中国对虾家系鉴别中的应用。结果表明,利用两对微卫星引物产生的DNA指纹图谱,能够有效地区分中国对虾4个家系。根据微卫星数据计算各家系之间的遗传距离,构建UPGMA图,得到的结果与各家系来源情况一致,进一步证明了微卫星技术在进行家系间的遗传分析中的可行性。EN0033和RS062两对微卫星标记的累积个体识别率高达0.989,属于高识别力的遗传标记系统,可以利用它们进行中国对虾的亲缘关系鉴定。     

适合中国对虾群体遗传多样性和系统进化分析的DNA分子标记技术

中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国海水养殖业中最具代表性的一项产业,优良种质和抗病力已成为对虾养殖业中迫切需要解决的问题。在遗传育种中若能筛选到与抗病、生长等数量性状紧密连锁的遗传标记,将为开展标记辅助育种工作和实现良种化奠定基础。对虾种质资源以及种群遗传学已成为研究热点,种群保护也已提到议事日程。这些研究工作的开展将为对虾良种选育提供理论依据,相信随着研究工作的继续深入,人们会更好、更有效地利用对虾资源。本文对目前已经在对虾遗传多样性和系统进化研究中进行应用的DNA标记技术方法进行分析总结,拟对今后其他物种开展相关工作提供借鉴。     

中国明对虾抗菌肽基因应答WSSV侵染的表达及其SNP分析

通过白斑综合征病毒(WSSV)感染实验,利用实时定量PCR技术研究了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)应答病毒侵染后,已知的3种抗菌肽(对虾肽)在肝胰腺、肌肉、肠和鳃4种组织中的差异表达情况.结果显示,虽然3种抗菌肽表现出明显的组织表达特异性,即在不同组织中的表达趋势和表达丰富度存在明显的差异,但是就同一个组织而言,3种抗菌肽在1～120 h WSSV侵染区间内的表达趋势基本一致,在0 h(未侵染病毒)时,3种抗菌肽的表达量极低(为0);在6～24 h期间,检测到明显的表达量;48～120 h期间,3种抗菌肽的表达量总体呈现下降的趋势.这暗示3种抗菌肽在对虾机体内可能具有相似的生物学功能.在此基础上,本研究对各类型中国明对虾抗菌肽的SNP位点进行了筛选,进一步对不同SNP类型与抗WSSV或易感WSSV的关联程度进行了分析,结果显示3种抗菌肽基因的SNP位点很少,且在抗性和易感对虾群体内不存在明显的偏向分布.