皱纹盘鲍一种丝氨酸蛋白酶抑制因子克隆与表达分析

通过RACE方法获得皱纹盘鲍丝氨酸蛋白酶抑制因子的cDNA序列.该序列全长1446个碱基,其中开放阅读框为410个碱基.该基因编码的氨基酸与丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族的结构相近.另外,在基因启动子区发现一些与免疫和癌症发生有关的转录因子结合位点.采用qRT-PCR方法分析该基因不同组织中表达情况,结果发现,在所有检测的组织包括外套膜、鳃、消化腺、血淋巴和肌肉中均有表达.另外,使用鳗弧菌感染并检测鳃组织中该基因表达情况,结果发现,细菌刺激后该基因表达量逐渐升高,表明丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在皱纹盘鲍抗菌反应中能够发挥免疫调节作用.     

中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的重组表达及活性分析

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应，进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程，在调节机体免疫及其它重要生理功能方面发挥着重要作用。我们在前期研究中，从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin, GenBank注册号：DQ318857），初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒（WSSV）引发的对虾先天免疫应答反应；本研究利用原核重组表达系统，成功获得了重组的对虾serpin型蛋白酶抑制剂（rFc-serpin），纯化复性后得率为0.3g/L；活性分析显示，重组目的蛋白（rFc-serpin）对多种病原菌的生长均有一定抑制作用，研究结果进一步证实它参与病原微生物引发的对虾防御应答过程，为探讨甲壳动物先天免疫防御应答机制提供了有价值的参考。     

螯虾免疫相关基因的检出及丝氨酸蛋白酶抑制物基因分析

通过对抑制性差减杂交和cDNA芯片技术分离的 2 0 1个阳性克隆的测序 ,得到螯虾 (Procambarusclarkii)免疫相关基因 4 8个 ,其中正向克隆中 4 2个 ,反向克隆 6个 ,除正向克隆中SNAP - 2 5 (synatosome-associatedproteinof2 5ku)已报道外 ,其余均为新基因 ,均在GenBank登录。正向克隆中的同源基因有微管蛋白、超氧化物歧化酶前体、丝氨酸蛋白酶抑制物Ⅰ、精氨酸激酶、70kD伴侣蛋白同类物等。进一步用DotNorthernblot对克隆号PCI188进行鉴定 ,结果攻毒组的杂交信号是对照组的 3.2 4倍 ,与cDNA芯片结果相符。用快速扩增cDNA末端技术扩增克隆号PCI188基因的 5’端片段和 3’端片段 ,全长共 112 8bp ,编码的蛋白质有 2 77个氨基酸 ,分子量为 30 .2 7kD。与GenBank序列号X795 12软尾太平剌蛄 (P .le niusculus)的蛋白酶抑制物Ⅰ (为丝氨酸蛋白酶抑制物 )的基因同源性为 5 8.7% ,氨基酸同源性为 6 9.7%。该蛋白质有 5个重复的结构域 ,与丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal家族的结构域相似     

白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的提取、纯化及其特性

从白鲢（Hypophthalmichthys molitrix）骨骼肌中分离纯化到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂的分子晕大约50kD，用PAGE-明胶电泳证明，该抑制剂对胰蛋白酶具有抑制作用；当温度超过60℃时，抑制剂的活性下降70％左右，但在pH3～11的范围内均有活性。用MTT法分析白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂对急性T细胞白血病细胞Jarkat、人骨髓瘤细胞Sp20和人骨瘤细胞MG63生长的影响，结果发现该抑制剂对以上3种肿瘤细胞的增殖都有抑制作用，而且抑制作用呈剂量依赖性。本研究旨为进一步研究白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化及其抗肿瘤作用提供科学依据。     

鳡肌肉生长抑制素(MSTN)基因的克隆及其组织特异性表达分析

以鳡肌肉总RNA为模板,采用RTPCR和RACE的方法,获得了鳡肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的3个重叠片段,测序后拼接得到2 177 bp全长cDNA序列,其包含了5′端非翻译区的89个核苷酸和3′端非翻译区1 052个核苷酸以及1 125个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸,其中前22个氨基酸为鳡MSTN的信号肽。鳡MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和在C端生物活性区含9个保守的半胱氨酸残基。核苷酸和氨基酸同源性分析发现鳡MSTN与厚颌鲂、草鱼和鲤等鲤形目鱼类的同源性较高,与鲈形目的同源性较低,与哺乳动物和鸟类的同源性最低;系统发育分析表明鳡MSTN与厚颌鲂亲缘关系最近。 半定量RT-PCR分析表明,该基因在肌肉和脑中表达量最高,在心肌中也有较高表达,在肝脏、肠、鳃和肾等组织中未见明显表达,此结果表明鳡MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能。     

Akt在中华绒螯蟹免疫中的功能

Akt作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子，在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥重要作用。本研究采用特异性引物及PCR技术，克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因 (EsAkt)并进行生物信息学分析，实时定量PCR技术检测了EsAkt在中华绒螯蟹不同组织和不同免疫刺激后的表达水平，免疫荧光技术检测了EsAkt蛋白的细胞定位，双链RNA干扰技术分析了EsAkt干扰后凋亡基因的变化。结果显示，EsAkt分子包含PH结构域、中心催化结构域 (S_TKc)和羧基端疏水结构域 (S_TK_X) 3个保守的结构域。EsAkt在所有被检测的组织中呈现组成型表达，且在免疫相关组织 (如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量显着高于胃和肠道。EsAkt蛋白主要以弥散状的形式分布在细胞质中。中华绒螯蟹注射脂多糖 (LPS)和嗜水气单胞菌后，显著诱导EsAkt转录本的表达，LPS免疫刺激12 h后，EsAkt响应达到峰值，为对照组的4.35倍，刺激48 h后，EsAkt的mRNA表达水平有所降低，但仍是对照组2.62倍。嗜水气单胞菌免疫刺激6 h后，EsAkt响应达到峰值，为对照组的9.05倍，刺激48 h后，EsAkt的mRNA表达量回落到正常水平。双链RNA干扰EsAkt后，EsAkt的mRNA表达量为对照组的0.38倍，而凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调，为对照组的2.69倍。研究表明，EsAkt基因在中华绒螯蟹免疫中发挥重要作用，参与了机体对细菌引起的免疫应激过程。本研究丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT信号通路研究的基本资料，为进一步研究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。     

草鱼LPL基因的表达及饥饿和再投喂对其影响

获得了草鱼脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)部分cDNA序列（GenBank注册号为FJ612596），并进行了序列同源性分析；采用半定量反转录聚合酶链式反应（SQ-RT-PCR）方法，检测了LPL基因在草鱼不同组织和不同发育阶段脂肪细胞中的表达状况；研究了饥饿和再投喂对草鱼肝胰脏LPL基因表达的影响。结果显示，所获得的草鱼LPL部分cDNA序列长度为360 bp，与其它物种的同源性为70%~89%； LPL基因在肝胰脏、肌肉、心脏、鳃、腹腔脂肪组织中均表达，其中在腹腔脂肪组织中表达丰度最高，在鳃中表达丰度最低；在成熟脂肪细胞中的表达丰度显著高于基质脉管组分（stromal vascular fraction,SVF）细胞；草鱼LPL基因表达水平在饥饿48 h后显著升高，再次投喂后12 h，回复到0 h的表达水平。研究表明，草鱼LPL在不同组织及脂肪细胞分化的起始和终末阶段均有表达，显示其在草鱼不同组织和脂肪细胞分化中具有重要作用，同时，其表达水平受营养状况的调控。论文首次克隆得到草鱼LPL基因部分cDNA序列，并对其进行了表达分析，研究结果可为LPL在鱼类脂质代谢中的作用研究提供参考和依据。     

长牡蛎Htatip2的表达及其在不育三倍体雌性中的DNA甲基化

为探究DNA甲基化在长牡蛎性腺发育中的表观遗传调控机制，对长牡蛎Htatip2的同源性、系统进化、组织表达以及三倍体性腺可育型和不育型不同发育时期的基因表达和DNA甲基化谱进行了研究。结果显示，长牡蛎Htatip2的保守结构域与美洲牡蛎的Htatip2-like的保守结构域同源性最高。qPCR分析显示， Htatip2在各个组织中均有表达，其中在雌性性腺中的表达量最高。此外，该基因的表达量在可育型三倍体牡蛎性腺中随着性腺发育成熟而升高，在不育型三倍体牡蛎性腺中表达量变化不显著。BS-PCR分析显示，该基因的甲基化水平随着性腺发育成熟而降低，与基因表达水平成负相关性。双荧光素酶报告结果显示，甲基化的Htatip2启动子片段与未甲基化的片段相比，显著抑制了荧光素酶的活性。研究表明，长牡蛎Htatip2的DNA甲基化可能通过抑制基因表达参与了性腺成熟调控。本研究为表观遗传调控机制参与牡蛎性腺发育提供了重要参考依据。     

牛磺酸对红鳍东方鲀热应激转录调控机制的影响

为探究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响，以初始体重为（32.28±0.20）g的红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）作为研究对象，实验随机分为3组，每组设置3个重复，通过在低鱼粉饲料中分别添加3个水平的牛磺酸[0%（T1，对照）、1.0%（T2）和5.0%（T3）]，配制3组实验饲料。养殖56 d后，水温（28±0.3）℃，急性热应激30 min，取肝脏。使用RNA-Seq测序技术对3组红鳍东方鲀肝脏转录组进行分析，并分别对3个转录组测序文库进行两两比较，设置显著差异基因筛选条件为P<0.05，共获得167个差异表达基因，其中上调基因111个，下调基因56个。GO功能分析发现，在T3vsT1组中，差异表达基因（DEGs）显著富集在蛋白质分解过程、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、内肽酶活性、L-氨基酸肽的肽酶活性和肽酶活性。KEGG富集分析发现，T2vsT1组中，这些DEGs主要参与细胞黏附分子、神经活性配体-受体相互作用通路；而T3vsT1组中，这些DEGs主要参与神经活性配体受体相互作用和代谢途径。选取3个显著差异表达基因进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证，结果证明，转录组测序分析可靠；饲料中添加牛磺酸后，在急性热胁迫条件下，红鳍东方鲀可通过细胞黏附分子和神经活性配体-受体相互作用通路调控机体对温度的响应；随着牛磺酸添加量的升高，红鳍东方鲀主要通过代谢调节、神经活性配体-受体相互作用通路调控机体对温度的响应。本研究旨为研究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响和牛磺酸抗应激功能提供参考数据。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)丝氨酸蛋白酶Ⅰ-1基因多态性

采用重测序方法,利用牙鲆(Paralichthys olivaceus)野生个体,扩增了牙鲆丝氨酸蛋白酶(Serine protease)I-1基因的编码区(CDS)和2605 bp的启动子序列。在牙鲆丝氨酸蛋白酶I-1基因(Po SP I-1)编码区中筛选出9个单核苷酸多态性位点(SNPs),同时在其启动子区筛选出28个SNP位点。对感染鳗弧菌的抗病牙鲆和易感牙鲆进行了部分SNP位点的分型,通过分析CDS中SNP位点的分布情况,发现SNP365A/G位点在抗病个体中的AG基因型的基因频率是60%,高于易感个体的40%(P=0.01)。q RT-PCR结果显示,易感个体在细菌感染后,Po SP I-1相对表达量相比对照组呈下降趋势。在抗病个体中,Po SP I-1相对表达量相比对照组呈上升趋势,且高于易感个体。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因在牙鲆抗鳗弧菌感染中发挥重要作用,该基因的SNP365A/G位点是与牙鲆鳗弧菌感染相关的候选位点,该位点可作为牙鲆抗鳗弧菌选择育种的潜在标记。     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。     

饲料中花生四烯酸水平对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌能力的影响

为了评估饲料中花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)水平对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌能力的影响,分别以鱼油和混合植物油为脂肪源,设计了2个系列共9组不同ARA含量的等氮等能,且具备相同饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)和n-3/n-6比例的实验饲料,投喂对虾6周后,检测各组对虾在急性感染溶藻弧菌0、24、36和42 h时鳃组织中Toll受体、IMD(immune deficiency)和溶菌酶m RNA表达量,并统计感染后96 h内对虾的死亡情况。结果表明:1对虾摄食以鱼油为脂肪源的饲料[饲料DHA(22:6n-3)和EPA(20:5n-3)含量分别为5.85和3.83 mg/g饲料],其鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶m RNA表达量均随饲料中ARA含量的升高呈现先升高后下降的变化;0.56(B组)和0.87 mg ARA/g饲料组(C组)对虾溶菌酶m RNA表达量显著高于0.44(A组)、1.02(D组)和0.28 mg ARA/g饲料组(E组)(P0.05);对虾摄食以植物混合油为脂肪源的饲料(DHA和EPA含量分别为3.28和1.87 mg/g饲料),其鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶m RNA表达量随饲料中ARA含量的升高而升高;1.44 mg ARA/g饲料组(I组)对虾Toll受体m RNA表达量显著高于0.19 mg ARA/g饲料组(F组)(P0.05)。2人工急性感染溶藻弧菌后,各组对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶m RNA的表达量随感染进程均出现显著变化。摄食以鱼油为脂肪源的饲料时,对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶m RNA表达量峰值均出现在0.56 mg ARA/g饲料组(B组),且峰值分别出现在感染后24、42和24 h。摄食以混合植物油为脂肪源的饲料时,对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶m RNA表达量峰值均出现在1.44 mg ARA/g饲料组(I组),且峰值分别出现在感染后24、42和36 h。3各实验组对虾急性感染溶藻弧菌后96 h累积死亡率无显著差异。本研究表明,饲料ARA水平影响凡纳滨对虾免疫相关基因(Toll受体、IMD和溶菌酶)的表达,且ARA调控免疫基因表达的效果受饲料EPA和DHA水平的影响。     

金属蛋白酶组织抑制剂在皱纹盘鲍抗弧菌免疫中的作用

由弧菌感染引起的疾病是影响鲍存活率的主要因素,实验以皱纹盘鲍为研究对象,探讨金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)在皱纹盘鲍抗弧菌免疫中的功能及其与基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1, MMP-1)的相互作用关系。实验通过PCR技术克隆得到了TIMP cDNA序列,全长为2 291 bp。利用NetNGlyc 1.0Server和NetOGlyc 4.0 Server软件对TIMP的氨基酸序列进行分析,结果显示,TIMP有3个潜在的N-糖基化位点,分别位于第47、77和152位的Asn,以及一个潜在的O-糖基化位点,即位于第108位的Thr。多序列比对结果显示,皱纹盘鲍TIMP氨基酸序列与杂色鲍、太平洋牡蛎、泥蚶中TIMP的序列相似性分别为76.0%、18.9%和19.3%。利用荧光定量PCR技术分析了副溶血性弧菌感染过程中皱纹盘鲍不同组织中TIMP的表达情况,发现在弧菌感染早期,TIMP在血淋巴细胞和鳃组织中的表达量均显著上调。利用RNA干扰技术分别敲低皱纹盘鲍TIMP和MM...     

转vp28蓝藻口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及免疫反应的影响

为探讨转vp28蓝藻(Anabaena sp.PCC7120)口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及其相应的免疫反应,本研究将此口服剂免疫幼虾7 d,再分别通过投喂攻毒和浸泡攻毒,测定其存活率及相应的免疫指标。投喂攻毒和浸泡攻毒的实验组存活率分别为78.8%和83.19%,表明该口服剂能显著增强对虾抗白斑综合征病毒的能力。蓝藻口服剂免疫对虾的酶活性检测结果显示,超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、过氧化氢酶(CAT)和碱性磷酸酶(AKP)活性在免疫后2 h均有上升趋势,且在48或96 h达到最高值,这表明该口服剂能引起对虾体内酶活性变化。投喂攻毒的对虾酶活性检测结果显示,实验组攻毒后的对虾肝胰腺SOD活性分别比阳性对照组、野生型组、空载体组显著提高42.10%、32.26%和16.04%,且攻毒后的肌肉SOD活性分别比阴性对照组、阳性对照组、野生型组和空载体组略微提高17.70%、11.50%、15.00%以及10.00%。实验组攻毒后的对虾肝胰腺PO、CAT和AKP活性比阳性对照组分别提高12.17%、88.80%和240.07%,比野生型组分别提高21.49%、30.90%和100%;酸性磷酸酶(ACP)活性比阴性对照组略微提高,而在肌肉中各组ACP活性无显著性差异。同时浸泡攻毒组结果与投喂攻毒组具有类似的趋势。浸泡攻毒的实验组CAT和AKP活性显著高于其余处理组,且CAT活性比投喂攻毒更为显著。浸泡攻毒的实验组肝胰腺PO活性显著高于阳性对照组、野生型组和空载体组,而各组肌肉ACP活性无显著性差异。研究表明,转vp28蓝藻口服剂能够增强凡纳滨对虾抗病能力并延缓对虾死亡。转vp28蓝藻PCC7120本身可作为幼虾饵料直接投喂,无需提取纯化,有望大规模应用于对虾养殖产业。     

罗氏沼虾胞质锰超氧化物歧化酶的功能

为了解超氧化物歧化酶 (SOD)分子生物学特性和免疫功能，实验克隆了罗氏沼虾胞质锰SOD基因 (MrcMnSOD)，制备多克隆抗体，并分析在嗜水气单胞菌感染下该基因的表达模式。结果显示，嗜水气单胞菌感染可显著诱导MrcMnSOD在转录水平和蛋白质水平进行高表达。为探究MrcMnSOD参与免疫应答的机制，进一步的抑菌实验表明，该蛋白质可显著抑制3种革兰氏阴性细菌 (大肠杆菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌)和2种革兰氏阳性细菌 (无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)的生长，且抑制作用与蛋白质浓度的关系不显著。研究表明，MrcMnSOD可能作为一种免疫相关分子参与免疫应答反应。本研究初步探讨了MrcMnSOD的免疫生物学功能，旨在为深入研究罗氏沼虾SOD的功能奠定相关基础。     

凡纳滨对虾C型凝集素（LvLc1）的特征和活性分析

C型凝集素是一种依赖于Ca~(2+)而发挥功能的糖蛋白,在一线的固有免疫防御过程中发挥着重要作用。围绕对虾C型凝集素开展深入研究,不仅可以丰富无脊椎动物固有免疫学内容,还有望将其开发为具有免疫增强效果的活性饵料,应用于对虾的健康养殖。本实验根据实验室前期转录组信息提示克隆获得了凡纳滨对虾一种新的C型凝集素基因(LvLc1,Gen Bank注册号:KY937940)。生物信息学分析显示LvLc1基因的开放阅读框全长891 bp,编码296个氨基酸,该基因编码的蛋白质含有一个保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),该结构域中具有潜在的半乳糖结合位点(QPD motif),进化发生分析显示LvLc1与来自节肢动物的甘露糖结合凝集素家族成员聚类在一起。对LvLc1基因的CRD结构域进行了原核重组表达与蛋白活性分析研究,结果显示:重组目的蛋白(rLvLc1)在Ca~(2+)存在的条件下,对多种病原菌(G~+、G~–和真菌)具有凝集作用,其凝集活性可被半乳糖、甘露糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制。研究表明,LvLc1作为C-型凝集素家族一个新成员,可能通过重要的模式识别受体作用,参与机体应答病原微生物侵染的防御过程。     

三疣梭子蟹LGBP基因的重组表达及微生物结合实验

将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30 ℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强的生物活性,其与丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌等均有结合能力。     

一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRN...     

饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响

为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。     

中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。