溶藻弧菌诱导马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库的构建及分析

为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制,筛选免疫防御相关功能基因,以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库;以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率;对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果显示,该文库的差减效率可达210倍;PCR阳性检测显示差减片段为100~750 bp,对随机挑取600个克隆的测序结果显示,共获得414个有效EST序列;通过BLAST同源性比对,有167个EST序列(占40.34%)与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性,其中7个EST序列(占1.69%)与免疫防御相关基因同源;此外,204个EST(占49.28%)在数据库中未发现同源序列。研究表明,SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因,研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础。     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

败血症鲢肝与肾cDNA文库构建及MHC classⅠ的克隆与分析

采用CloneMinerTM cDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库.经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5％,平均插入片段大于1.2 kb.对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功.经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列.在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25％.采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC classⅠ完整编码区的序列,该序列具有典型的脊椎动物MHC class Ⅰ的序列特征.本研究完成鲢肝和肾较高质量的cDNA文库的构建,旨在为今后开展鲢功能基因研究奠定基础.     

鲤脑组织cDNA文库的构建及脑室管膜素基因鉴定

用Gubler-Hoffman法构建了低温下鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)脑组织cDNA文库,经测定库容量为5.7×105 CFU/mL,文库的重组率接近95%,平均插入片段长度约为1.5 kb,符合文库保存和筛选实验的要求.同时,根据鲤与低温相关消减cDNA文库中低温下特异表达基因片段序列,设计PCR引物在此cDNA文库中进行PCR检测和序列测定,使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率近75%;以上结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高,可作为筛选与鲤低温性状相关的功能基因的重要资源.同时对其中一个与低温相关的基因脑室管膜素基因构建了表达载体,为进一步验证该基因在鱼类低温适应中所发挥的作用及其作用机理奠定了基础.     

仿刺参cDNA文库构建以及序列分析

应用Gubler-Hoffman cDNA Library Construction技术,构建仿刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库.测试结果表明,库容量为2.0×106 pfu/mL,利用PCR方法检测cDNA文库插入DNA片段的大小,其长度范围在0.5～4.1 kb,插入片段平均长度为1.3kb,表明该文库达到建库要求,可用来筛选低丰度mRNA的基因克隆.随机挑选100个1kb以上的cDNA克隆进行测序分析,发现有25条EST序列和网上公布的其他物种的序列相似性较高,这些基因与刺参能量代谢和蛋白水解相关.其中发现的几个重要基因,如编码遍在蛋白以及缬酪肽蛋白等的基因,可能与仿刺参自溶过程的蛋白酶水解和细胞凋亡事件相关,进一步的研究还在进行.另有49条EST序列相似性较低,推测可能是功能未知的新基因.仿刺参cDNA文库的成功构建,为下一步大量EST序列分析和功能性新基因的发现,以及从基因水平认识仿刺参这一特殊棘皮动物的生长、发育和代谢规律奠定了基础.     

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus)Ⅳ期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以间期性腺为试验方,Ⅳ期卵巢为驱动方;反向差减杂交以Ⅳ期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方.将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子.经PCR扩增鉴定插入片段范嗣为200～2000 bp.随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对.进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证.结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的.黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础.     

转录组测序筛选克氏原螯虾卵巢发育、免疫和生长相关基因

为发掘克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长的重要功能基因,采用Illumina HiSeq~(TM) 2 500高通量测序平台对克氏原螯虾的卵巢、肝胰腺和肌肉组织进行了转录组测序。所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、pfam、COG、GO和KEGG数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。结果显示,测序共获得了53 006个unigene,平均长度为1 194 bp。对3个组织样品的测序文库进行两两比较,发现在卵巢vs.肝胰腺中有差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)20 382个,在肝胰腺vs.肌肉中有DEG 12 753个,在肌肉vs.卵巢中有DEG 21 629个。GO功能分类分析发现,部分DEG被注释到繁殖(reproduction)、繁殖过程(reproduction process)、免疫系统过程(immune system process)和生长(growth)GO条目。KEGG pathway分析显示,一部分DEG在卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的信号通路中得到了富集。根据GO功能分类和KEGG信号通路分析筛选出了大量与克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的候选基因,如卵黄蛋白原、卵黄蛋白原受体、Toll样受体2、Toll样受体相互作用蛋白、肌肉生长抑制素和5-羟色胺受体等。本研究结果丰富了克氏原螯虾的基因资源,可为克氏原螯虾的遗传育种和免疫研究提供基础数据。     

应用RD-PCR技术构建溶藻弧菌的cDNA文库

应用限制性显示PCR(RD-PCR)技术构建溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进行测序,根据测序结果进行生物信息学分析和结果验证。实验结果表明,我们成功地构建了溶藻弧菌poly (A)化mRNA的cDNA文库,获得一百多个基因片段并对其中53个基因片段进行测序分析,获得了如细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶等毒力相关因子的基因片断。并且在一定程度上证实了poly(A)化在细菌中不是个别和偶然的现象。实验结果说明了我们所构建的溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库质量高,文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。本文并探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA的cDNA1文库构建中的应用价值。     

鲤的微卫星标记与体质量、体长、体高和吻长的相关分析

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)Vc缺乏诱导的差异表达基因.实验用皱纹盘鲍成鲍初始体质量为(74.32±0.43)g,初始壳长为(84.36±0.24)mm.配制了Vc缺乏(0.0 mg/kg)和高剂量添加(4 967.5 mg/kg)2个水平的人工饲料进行饲喂.经过170d的养殖后,分别构建肝胰腺和肾脏Vc缺乏消减cDNA文库.消减杂交效率分析显示,差异表达的基因分别被富集了大约25和25～210倍.从两个文库中随机挑选阳性克隆进行测序.在肝胰腺消减cDNA文库中获得63个片段,其中已知功能基因占54.0%,Gene ontology(GO)按照功能将其分为4类:代谢相关基因占15.9%,细胞代谢相关基因占30.2%.生物调节相关基因占4.8%,其他功能基因占3.2%.未知功能基因占46.0%.在肾脏消减cDNA文库中获得39个片段,其中已知功能基因占53.8%,GO将其分为3类:代谢相关基因占5.1%,细胞代谢相关基因占28.2%,生物调节相关基因占20.5%.未知功能基因占46.2%.其中,获得了包括细胞色素c氧化酶、葡萄糖-1脱氢酶、α-葡萄糖苷酶、β-1,3-D-葡聚糖酶、纤维素酶、藻酸盐裂解酶以及铁蛋白等在其他动物中被证明与Vc合成相关的基因,为进一步研究皱纹盘鲍Vc的合成和代谢奠定了基础.     

仿刺参体壁、肠和呼吸树全长cDNA文库的构建及部分ESTs初步分析

利用SMART cDNA文库构建试剂盒构建了健康仿刺参的体壁、肠和呼吸树的cDNA文库.检测结果表明,3个文库库容量分别为1.7×106、1.5×106和1.8×106;重组率均超过98%,插入片段平均长度均大于1 kb.证明所建cDNA文库的质量符合要求.对随机选取的6240个克隆进行5'端测序,得到5913条有效序列(体壁,2031,肠:1966,呼吸树:1916),去除低质量序列和小于100 bp的序列后,共得到5728条高质量的ESTs序列(体壁:1791,肠:1906,呼吸树:1851),序列平均长度为589 bp.经过软件拼接.共得到2613条单基因簇,包含495个序列重叠群和2118条单一序列.通过BLASTX搜索比对,获得基因注释序列853个(体壁:274个;肠:358个;呼吸树:221个),占总数32.6%,并进行了初步的功能分类.为进一步开展相关基因的克隆和分子标记的筛选莫定了基础.     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

不同年龄细鳞鱼的繁育效果

研究了不同年龄组(3～8龄)细鳞鱼(Bachymystax lenok Pallas)亲鱼的繁育效果,分析其繁育主要技术,包括亲鱼培育、繁育技术、受精卵孵化、鱼苗培育等,结果发现,5～6龄和7～8龄细鳞鱼产卵量没有明显差异,产卵量、孵化率、出苗率均较高,繁殖效果明显好于3～4龄亲鱼。     

海口市近海渔业资源衰退的原因分析与对策建议

在分析海口市海洋渔业资源和海洋捕捞现状的基础上，提出了近海渔业资源衰退的6项原因和加快保护和修复资源的10项措施和建议。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

鱼类热忍耐温度研究进展

The paper is a review of the studies on the temperature of the thermal tolerance in fishes. It was described from four aspect: (1) The key parameters of temperature of thermal tolerance in fishes; (2) The influence factors of temperature of thermal tolerance in fishes; (3) The research methods of thermal effect of fishes; (4) The evaluation of effects of thermal pollution on fishes, especially, with the coastal power station will be‘built in China recent years, the effects of thermal discharge water on the marine fisheries resource wered iscussed.