海带雄配子体抑制消减cDNA文库的生物信息学分析

对海带(Landnaria japonica Axesch.)雄配子体抑制消减cDNA文库进行生物信息学分析,并通过Northern印迹杂交进一步验证了雄配子体2个优先表达的基因.结果表明,(1)由627个克隆产生的618条高质量cDNA可聚类成187条非冗余序列(NRS);其中93条Contig由524条cDNA拼接而成,剩下的94条为Singleton(只有单条cDNA),冗余率达69.74%.(2)5条NRS因与rRNA基因相匹配而不进行分析;60条NRS与GenBank中注释蛋白基因显著匹配;122条NRS无显著匹配.(3)大部分已知功能的基因与物质和能量代谢(26.7%)、生长发育(13.3%)有关,其中与叶绿体光捕获蛋白复合体有关的基因有106条cDNA,所涉及的有lhcf6基因(62条cDNA)与fcp基因(12条cDNA)等.(4)经Northern印迹杂交证实lhcf6和fcp2个基因在处于营养生长期的雄配子体中优先表达.(5)90条Contig的总G+C含量平均值为52.58%,表明了密码子的使用对G、C有明显的倾向性;20个推测功能蛋白(1520密码子)密码子第三位碱基的使用偏好C(40.7%),其次是G(33.9%);终止密码子的使用偏好TGA(54.5%).本研究为海带雌、雄配子体差异表达基因克隆、分析和功能基因组学等研究提供了信息.     

海带配子体克隆育苗的关键技术

海带配子体克隆育苗生产技术工艺包括克隆的扩增培养、采苗及幼苗培育3部分。从生产应用的角度总结并探讨了海带克隆育苗工艺中各环节的关键技术。     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。     

光照强度对海带配子体克隆生长的影响

本试验研究了在充气悬浮培养及静置培养条件下，不同光照强度对海带配子体克隆生长的影响。结果表明：在4500lx光照强度、充气悬浮培养条件下，海带配子体克隆具有较高的瞬时生长率。     

施氏鲟精巢和卵巢差减cDNA文库的构建和差异表达EST的筛选

应用抑制差减杂交（SSH）技术构建了施氏鲟（Acipenser schrenckii）精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cDNA差减文库，从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测，随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较，发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性，68个片段与已报道的基因有较高的同源性，其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因，而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子（EF-1）和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因，而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。这些EST数据为进一步筛选和克隆鲟鱼性腺组织特异性表达基因提供了材料平台，为鲟鱼基因组数据增补了大量信息。     

海带配子体克隆培育杂种优势苗种的研究

用日本长海带雌性克隆与海杂海带雄性克隆杂交获得优势苗种LJ组合,它对双亲孢子体表现出明显的杂种优势,与对照组相比,其长度、宽度、株鲜重、株干重均表现出明显的优势,并且生长均匀、变异程度小,具有广泛的应用前景。     

海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

铁离子对海带配子体克隆系生长发育的影响

为了探究Fe³⁺在不同氮、磷条件下对海带（）配子体生长发育的影响,以海带''黄官1号''雌、雄配子体克隆系为材料,以含有不同浓度的氮（N）、磷（P）营养盐的灭菌海水为培养液,添加不同浓度（0μmol/L、0.36 μmol/L、3.60 μmol/L、8.90 μmol/L、17.80 μmol/L）的铁离子（Fe³⁺）,通过测定光系统Ⅱ的最大荧光产量（）观察配子体营养生长状况,通过计算发育率（包括卵囊形成率、排卵率、幼苗形成率）观测配子体发育与生殖状况。结果显示,N、P浓度分别为0.825 mmol/L、0.0336 mmol/L的条件下,浓度为3.60 μmol/L的Fe³⁺对海带配子体营养生长阶段的促进作用最大;在不同N、P浓度条件下,Fe³⁺浓度为3.60~17.80 μmol/L时能够提高海带配子体的最大荧光产量,且各浓度组之间没有显著性差异（3+能够促进海带配子体由营养生长转向生殖生长,Fe³⁺浓度为3.60~17.80 μmol/L时可显著促进海带配子体的生殖生长,且各浓度组之间没有显著性差异（>0.05）;即使N、P浓度达到0.825 mmol/L、0.0336 mmol/L,在无铁条件下所有的海带配子体维持在营养生长状态;即使Fe³⁺浓度达到3.60 μmol/L,在N、P浓度0.007 mmol/L、0.0003 mmol/L条件下,大部分海带配子体（65%）维持在营养生长状态,虽然小部分海带配子体（35%）进入了生殖生长状态,但生殖生长明显滞后于实验中的其他各个N、P浓度组。本研究表明,铁和N、P营养盐对海带配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用,铁是海带配子体由营养生长到发育成熟再到有性生殖过程中的关键因素;在添加适宜浓度的氮（0.275 mmol/L）、磷营养盐（0.0112 mmol/L）条件下,浓度为3.60 μmol/L的Fe³⁺对海带配子体的生长发育促进作用最大。该结果可为提高海带育苗效率提供理论依据。     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...     

重离子束辐射对海带配子体克隆的影响

利用12C重离子束对东方海洋种质库保存的8个海带配子体克隆系进行3次辐射试验,辐射剂量分别为10、20、40、50、60、80、120、160、200和240 Gy.结果表明,使海带配子体克隆细胞发生变化的最低辐射剂量为60 Gy,随着剂量的增大,细胞死亡增多,240 Gy辐射剂量下仅有一个克隆系存活;80 Gy辐射剂...     

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

海带工厂化低温育苗法及其科学技术基础

海带工厂化低温育苗是一项综合性技术措施,其中心环节是海带的“夏繁”和配子体、幼孢子体的“越夏”。围绕着这二个中心环节,试验研究取得了夏熟种海带培育、集约式平面采光、人工附着基的改进和制作、育苗期间的温光控制和制冷工艺、病害防治、以及水的循环与净化等配套技术和成果,有效地促进了海带养殖业的发展。本试验根据海带生物学特性,以人工模拟的环境条件,结合考虑经济上的合理性,培育出大量幼苗,这对海洋及内陆水域中其他生物资源的开发利用提供了有参考价值的途径。     

孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减cDNA文库的构建及分析

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库.获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS).片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp.参与比对的EST片段按照...     

斑节对虾性腺差异表达基因的筛选

以池塘养殖250日龄的斑节对虾性腺组织为材料,利用mRNA差异显示(differential display,DD)筛选性腺差异表达基因,获得173条雌、雄性腺差异表达片段。随机选取44条差异片段进行回收、克隆、测序及Real-timeRT-PCR验证,最终获得10条阳性差异表达片段,其中OA7-1、OA7-2、OG8-1、OG8-2、OC1-3、OC4-2、OC8在卵巢中表达量极显著(P<0.01)高于精巢,TG6-3、TG8在精巢中表达量极显著(P<0.01)高于卵巢,TC1为精巢特异表达片段。序列分析表明OA7-2为脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase)(E值6e-54);OG8-1为真核细胞翻译起始因子3亚单位4(eIF-3delta)(E值9e-58);OC1-3为未命名蛋白产物(unnamed protein product)(E值2e-17);OC4-2为60S核糖体蛋白L7(RPL7)(E值6e-40);OC8为60S核糖体蛋白L3(RPL3)(E值5e-36);OA7-1、OG8-2和TC1与BLASTx比对同源性较低(10-4相似文献   

尼罗罗非鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因的筛选

应用引物退火控制技术(ACP)筛选尼罗罗非鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因,寻找与雌雄鱼肌肉生长发育相关的候选基因。本实验从同等条件下养殖的尼罗罗非鱼群体中随机选取雌、雄鱼各5尾组成RNA池,采用引物退火控制技术,分析了两组个体肌肉组织差异表达基因。利用20对随机引物差异显示扩增,共获得8条ESTs,其中5个已知的ESTs分别为转录变体3(LOC100691543)、60S核糖体蛋白(RL3)、小白蛋白β样蛋白、肌型肌酸激酶M2-CK和转录因子Sox4,其余3个为未知的ESTs。实时定量PCR分析各差异表达基因在尼罗罗非鱼雌雄肌肉组织中的表达发现,8个差异表达基因中转录变体3与ACP6-Y在尼罗罗非鱼雄鱼肌肉组织中的表达均极显著高于雌鱼(P0.01),ACP3-X、60S核糖体蛋白(RL3)、小白蛋白β样蛋白、ACP15-X、肌型肌酸激酶M2-CK与转录因子Sox4在尼罗罗非鱼雌鱼肌肉组织中的表达均极显著高于雄鱼(P0.01)。结果表明,应用引物退火控制技术筛选获得了8个可能参与了雌雄鱼肌肉生长发育调控的ESTs,为进一步筛选雌雄鱼肌肉生长发育相关候选基因奠定了基础。     

黄鳝生长差异基因发掘及其调控机制初步研究

为揭示黄鳝(Monopterus albus)生长相关基因的调控机制,对相同亲本具有显著性生长差异的黄鳝肝脏进行了转录组测序分析。结果显示,转录组测序共得到19149个基因,其中差异基因598个,差异基因中有303个基因显著上调,295个显著下调。KEGG通路分析发现,598个差异基因分属262条通路中,其中有38条通路显著富集。GO功能注释发现,与生长相关的差异基因有7个,分别为col1α1、nkx6.1、nnos、plexina4、igfbp1、pcgf1和h3.3,这些基因表达水平的变化可能对黄鳝神经、内分泌和消化系统的发育及生理活动产生了调节作用从而影响了黄鳝的生长。结合KEGG通路分析发现,col1α1所在的利什曼病通路和nnos所在的精氨酸和脯氨酸代谢通路富集显著,说明其对黄鳝生长具有重要调节作用。     

大菱鲆脾脏cDNA文库构建、EST序列分析与免疫抗病相关基因的筛选

以大菱鲆脾脏为材料,构建cDNA文库,通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得3 656个大菱鲆脾脏表达序列标签（EST）。经与GenBank数据库的序列比对后发现,1 891个EST代表了149个已知基因,其余1 765个EST为未知序列。这149个基因大致可分为6类：9个为细胞结构类（6.0%）;26个为代谢类（17.5%）;45个为细胞防御/免疫类（30.2%）;43个为基因/蛋白质表达类（28.9%）;16个为细胞信号转导/细胞交流类（10.7%）;10个无法明确分类（6.7%）。鉴定的与免疫抗病相关重要基因主要有：CC/CXC趋化因子;主要组织相容性复合体（MHC）class I α;C₃补体;天然杀伤细胞增强因子（NKEF）;胸腺素β-4/β-12;干扰素诱导蛋白Gig1;白介素8受体;STAT 4;热激蛋白70/90等。