患腹水病牙鲆病原菌分离、鉴定及病原菌的特性

为确定引起河北北戴河地区养殖牙鲆患腹水病死亡的病原,本实验从患腹水病牙鲆体内分离到3株优势菌,对分离株进行生理生化鉴定和16S rRNA序列比对来确定分离株的生物学地位,进一步通过毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)鉴定及组织病理学分析其病理特征,并通过人工回感实验分析分离株毒性。结果显示,通过生理生化实验及16S rRNA序列比对,确定此次从患病牙鲆中分离到的3株菌株均为哈维氏弧菌;经鉴定,3株分离株毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)结果均为阳性,病理组织切片结果显示,该分离株对牙鲆多器官(肠、肾脏、脾脏和肝脏)均可造成不同程度的病理损伤,呈全身性感染;人工回感实验显示,菌株BDHYPFS-Y1G对牙鲆的半致死浓度为LD50=5.88×106 CFU/mL,低于自然状态毒性;药敏实验表明,3株分离株均对呋喃妥因高度敏感。本实验确认了此次牙鲆腹水病的病原菌,并初步研究了病原菌致病性以及药物敏感性,以期为牙鲆工厂化养殖疫病防控提供科学依据。     

虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是导致养殖对虾暴发弧菌病的重要病原之一。从我国南方养殖凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)分离、鉴定了10株哈维氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487),分别肌注感染健康凡纳滨对虾后发现,菌株Vh21229致病性很弱,Vh00949其次,其它菌株毒力较强;对8种哈维氏弧菌常见毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、tox S、hcp、zot和pap6)的检测显示,南方虾源哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxs和4种Vh基因(≤10%),表明这10个菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低;hcp基因在所有菌株中均有检出,其中强毒株中检出率较高(50%),在较弱毒株(Vh00949)中也存在,表明hcp基因与这些菌株的致病性密切相关,但不是决定性因子。因此,这10株南方虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测到的因子所决定。生化特征分析显示,所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖,而且只有其赖氨酸脱羧酶反应至阳性,而其它菌株均为阴性,推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响。药敏实验表明,10株哈维氏弧菌均对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感,而对氨苄西林耐受性强,表明在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用。     

弧菌对斑节对虾虾苗致病性的研究

本文用6种弧菌对斑节对虾虾苗进行致病性试验。发现6种弧菌对各阶段幼和仔虾都有很强的致病作用。其中,对蚤状幼体致病性最强,其次是无节幼体、糠虾和仔虾。     

丰年虫发光弧菌药敏筛选及应用

<正>丰年虫又称盐水卤虫,是一种普遍应用于水产苗种培育的饵料生物。依据我国水产养殖标准GB/T 30890-2014《凡纳滨对虾育苗技术规范》,丰年虫无节幼体应用于南美白对虾糠虾与仔虾阶段。我国对虾发光病主要发生于福建、浙江、广东等沿海地区,主要危害凡纳滨对虾和斑节对虾。目前的研究表明,引起对虾发光病的病原菌有霍乱弧菌(V.cholerae)、灿烂弧菌(V.splendidus)、火神弧菌(V.logei)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和费氏弧菌(V.fischeri)5种,但其主     

溶藻弧菌VZ5株在凡纳滨对虾育苗中应用的研究

在凡纳滨对虾育苗涵状幼体期以不同频次添加溶藻弧菌VZ5株，并在糠虾幼体后搭配添加芽孢杆菌Bz5株，测定育苗过程中水质、水体中弧菌密度变动以及对虾幼体生长和存活状况，研究溶藻弧菌VZ5株在凡纳滨对虾育苗中应用的效果。结果表明，添加溶藻弧菌的3个处理组仔虾期氨氮浓度显著低于对照组；仔虾期幼体干重分别为0．0463±0．0009、0．0420±0．0006、0．0407±0．0009g／尾，显著高于对照组（0．0253±0．0003g／尾）。滏状幼体期每天添加溶藻弧菌的处理组幼体成活率显著高于其他处理组（P〈0．05）。溶藻弧菌VZ5株能够有效降低水体中氨氮的积累和促进对虾幼体生长。     

凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90%;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31%;gapA序列与坎氏弧菌EF596552相似度为98.89%;采用坎氏弧菌种特异性引物对PvL-1进行PCR分析,可扩增出坎氏弧菌种特异性片段,不能扩增出轮虫弧菌和哈维氏弧菌特异性片段,上述结果表明PvL-1为坎氏弧菌成员。分离菌株在10%脱纤维羊血平板呈β溶血,脱脂奶粉平板出现明显透明圈,表明存在溶血性和胞外蛋白酶活性。分析了PvL-1的急性肝胰腺坏死病、溶血素基因、菌毛基因和其他毒力基因,表明PvL-1具有AP4、TLH、vcahHly、flaC、mukF、gloB、sodB和esrB等毒力基因。PvL-1可使健康凡纳滨对虾发病死亡,濒死凡纳滨对虾与自然发病虾呈现类似症状,对凡纳滨对虾半数致死浓度(LD50)2.94×104 CFU/尾;病理组织观察发现,人工感染发病凡纳滨对虾肝胰腺小管细胞脱落、崩解、血细胞浸润等,与自然发病凡纳滨对虾病理特征相同。研究表明,本次实验分离到可发光的坎氏弧菌PvL-1,对凡纳滨对虾有较强致病性,拓展了对凡纳滨对虾发光坎氏弧菌的认知。     

2株副溶血弧菌不同盐度下致病性和毒力基因差异分析

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常见的食源性致病菌和海水养殖动物致病菌,目前已知的毒力基因有tlh、tdh、trh、T3SS、pirA、pirB、toxR/S、orf8等。盐度是影响细菌基因表达的关键生态因子之一,为进一步探求副溶血弧菌的致病机理,对2株分别分离自海水和淡水养殖发病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的副溶血弧菌在不同盐度下的生长速率、致病性进行检测,并用q-PCR方法对菌株毒力基因携带和表达情况进行定量研究。实验结果表明:海水菌株383生长速率快于淡水菌株V9,但菌株383在生长稳定期的细菌浓度明显低于菌株V9;菌株383对凡纳滨对虾的致病性明显高于菌株V9,前者的48 h半致死浓度(LD_(50))低于后者2个数量级;2株副溶血弧菌皆携带毒力基因tlh、T3SS1和pirA/B,但未检测到tdh、trh、T3SS2、toxR/S和orf8。部分毒力基因表达量检测结果显示,菌株383和菌株V9均为vcrD1表达量最高,其次是pirA,vopD1表达量最低;4个毒力基因不仅在2菌株间的表达量差别较大,而且盐度对同一菌株不同毒力基因表达的影响也是不同的。2株副溶血弧菌的毒力与pirA和vcrD1的表达量呈正相关性。研究结果为探究环境因素与副溶血弧菌致病力的关系提供了科学依据,同时也提示,淡水养殖凡纳滨对虾要防范副溶血弧菌输入的风险。     

基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立

基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法.试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μ...     

5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae)的Mcp基因作为靶基因，设计特异性引物，通过优化反应体系和条件，并在微流控芯片进行集成，建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示，本研究所建立的检测技术最佳反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，Primer F/R各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 1 μL。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现，在109~104 copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强，对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20 CFU/mL，显示出较高的灵敏度，且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。     

凡纳对虾(Litopenaeus vannamei Boone)幼体淀粉酶(Amylase)和脂肪酶(Lipase)活力的研究

本文以酶学分析方法测定了凡纳对虾状幼体,糠虾和仔虾三个发育期淀粉酶和脂肪酶的活力。实验结果表明,糠虾期淀粉酶比活力显著高于状幼体和仔虾两期(P<0.05);脂肪酶比活力状幼体显著高于糠虾幼体(P<0.05)。在食性转化过程中,凡纳对虾幼体消化酶活力与其食性相适应,不同发育阶段消化酶调节机制不同。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

发病鲆鲽类分离菌株的16S rRNA基因测序分析

细菌性疾病是中国海水养殖鲆鲽类的主要病害,为全面了解病原菌种类,本研究对1999~2012年从山东、江苏、河北、天津等沿海地区养殖场发病鲆鲽鱼类中分离得到的124株优势菌株进行了16S rRNA基因测序和系统发育学分析。将基因序列与GenBank核酸序列数据库进行相似度比对分析,结果显示,有83株与弧菌属(Vibriosp.)细菌相似度最高,11株与气单胞菌属(Aeromonas sp.)细菌相似度最高,4株与爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)细菌相似度最高,26株为其他15种属的细菌。根据系统发育学分析结果,进一步将66株菌鉴定为16个种,优势种为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。选择其中的9株鳗弧菌和4株迟缓爱德华氏菌进行人工感染实验,结果显示,其中7株鳗弧菌和3株迟缓爱德华氏菌对大菱鲆(Scophthalmus maximus)有较强的致病性。研究结果可为阐明中国海水养殖鲆鲽类的流行病发生历史、病原种类、病原监测及疾病控制提供重要参考。     

矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立

取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。     

鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力

为调查鱼源气单胞菌毒力基因与其致病力的相关性,以2009—2018年从不同患病鱼分离的173株气单胞菌为研究对象,通过检测毒力相关基因、测定溶血活性、腹腔注射感染异育银鲫等方法开展评价。通过管家基因gyrB分子鉴定结果显示,173株气单胞菌中维氏气单胞菌(119/173,68.9%)和嗜水气单胞菌(50/173,28.9%)是主要流行的菌株。10个毒力基因aer(162/173,93.64%)、act(131/173,75.72%)、ast(55/173,31.79%)、alt(58/173,33.53%)、lip(152/173,87.86%)、exu(154/173,89.02%)、fla(143/173,82.66%)、gcaT(148/173, 85.55%)、 eprCAI(41/173, 23.70%)和ahyB(51/173, 29.48%)普遍存在于173株气单胞菌中。依据检测到的毒力基因数量从多到少分布情况,这些菌株可分为7大类(Ⅰ～Ⅶ)53个毒力基因型。大部分嗜水气单胞菌检测到8～10个毒力基因,主要分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因型;维氏气单胞菌的eprCAI、ahyB、 ast和alt等4个毒力基因检测率低,主要分布于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ类基因型。大部分气单胞菌(94.22%,163/173)具有溶血活性。代表性毒力基因型的38株维氏气单胞菌和20株嗜水气单胞菌腹腔注射异育银鲫攻毒结果显示,3.0×106 CFU/尾的剂量下,3株维氏气单胞菌使鲫死亡率达80%～100%,16株嗜水气单胞菌使鲫死亡率达90%～100%。研究表明,维氏气单胞菌是目前最主要流行的气单胞菌,但其检测到的毒力基因普遍少于嗜水气单胞菌,且对异育银鲫的致病力普遍弱于嗜水气单胞菌。本研究能够为气单胞菌败血症的流行病学调查和疫苗研究提供理论依据。     

长鳍真鲨源哈氏弧菌的主要生物学性状研究

从两尾病死的观赏用长鳍真鲨Oceanic whitetip shark，Carcharhinus longimanus L．中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等生物学性状检验。同时，测定了16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发育树。结果表明，8株供试纯培养菌（编号：HQ050226—1至HQ050226—4、HQ050227-1至HQ050227—4）为弧菌属（Vibrio Pacini 1854）的哈氏弧菌（Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936）。所扩增的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区），HQ050226—1株为1463bp（GenBank登录号：EF635305）、HQ050227—1株为1464bp（GenBank登录号：EF635306），与GenBank数据库中哈氏弧菌的同源性在98％及99％。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等33种敏感。     

Vibrio harveyi as a causative agent of mass mortalities of megalopa in the seed production of swimming crab Portunus trituberculatus

Outbreaks of mass mortalities among cultured megalopa of swimming crab (Portunus trituberculatus) occurred in a commercial hatchery during the spring of 2012 in Jiangsu province, P. R. China. Dominant bacteria were isolated and characterized by biochemical reactions, enzyme production, and sequencing analysis of the 16S rRNA, gyrB (DNA gyrase B subunit) genes, and two strains (DY1 and DY2) were selected as representative strains for virulence tests by immersion. The results showed that the characteristics of identified strains consist with Vibrio harveyi; the 16S rRNA and gyrB genes of the tested strains exhibited high similarity with V. harveyi; and the phylogenetic trees constructed using the neighbor-joining method based on 16S rRNA and gyrB genes. Two strains (DY1 and DY2) clustered with the V. harveyi and were supported by a higher bootstrap value, and two strains (DY1 and DY2) were found lethal to the healthy megalopa and juvenile crab. LD ₅₀ of DY1 and DY2 to megalopa and juvenile crab were 2.4 × 10⁶, 3.0 × 10⁶, 1.9 × 10⁶ and 2.5 × 10⁶ CFU/ml, respectively. The results confirmed that the diseased megalopa were infected by V. harveyi. In addition, we analyzed the tested strains (DY1 and DY2) by PCR for the presence of virulence genes that were known in V. harveyi, and the results showed that five virulence genes (luxR, toxR, vhhA, vhhB and pap6) were detected by a specific PCR assay, further supporting the assignment of isolates to V. harveyi and its pathogenicity. To our knowledge, this is the first report of V. harveyi as pathogenic bacteria of megalopa of swimming crab.     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。