不同倍性鲫鲤性腺型芳香化酶cyp19a1a基因cDNA的克隆及表达

为研究性腺型芳香化酶P450aromA(cyp19a1a基因编码)在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的作用,实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的cyp19a1a基因cDNA全长。结果显示,3种鱼cyp19a1a基因均编码517个氨基酸残基,而且编码的蛋白都包含P450aromA特有的跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol’s肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。采用RT-PCR分析cyp19a1a基因mRNA在3种不同倍性鱼类组织中的表达情况,结果显示,cyp19a1a基因主要在实验鱼的卵巢中表达,其次在精巢、脑、脾脏有少量表达。采用实时荧光定量PCR对cyp19a1a基因mRNA在不同倍性鱼卵巢中的表达进行分析,结果发现,cyp19a1a基因在不同倍性鱼的非繁殖期卵巢的表达都高于繁殖期卵巢,并且在繁殖期和非繁殖期,cyp19a1a基因在三倍体湘云鲫的表达量高于二倍体红鲫和四倍体鲫鲤。采用免疫组织化学方法对CYP19A蛋白在不同倍性鲫鲤卵巢中的定位进行分析,结果发现,CYP19A蛋白主要定位在滤泡细胞、Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上以及Ⅱ时相卵母细胞的卵浆中。研究表明,性腺型芳香化酶在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的表达存在一定的差异性,三倍体鱼cyp19a1a基因mRNA水平表达异常,推测与其不育有关联性。     

异源四倍体鲫鲤及亲本ApoE的克隆及组织表达分析

载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)作为胆固醇代谢过程中的关键因子,参与脂蛋白转运和性腺发育。为进一步了解该基因的作用,本实验克隆并测序了异源四倍体鲫鲤及其父母本ApoE基因的全长序列。异源四倍体鲫鲤、红鲫和鲤的ApoE全长分别为1393 bp、1384 bp和1396 bp,均编码281个氨基酸。序列对比表明,异源四倍体鲫鲤ApoE与父本鲤更为相似。另外有2个氨基酸位点发生了与父母本均不同的变异,证明异源四倍体鲫鲤除了有杂交特征外也产生了变异。通过Mega软件构建的哺乳动物ApoE进化树与系统分类相一致:鲤科鱼类的ApoE聚类在一起而分离于其它物种。Real time PCR分析表明,ApoE基因在3种鱼中的组织表达模式基本一致,所有组织均有表达,而在脾脏中表达最高。     

蛋白磷酸酶PP-1c在不同倍性鱼6种组织中的分化表达模式

以异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本(湘江野鲤/红鲫)和子代三倍体湘云鲫等为实验材料，运用Western-blotting技术及荧光免疫组织化学技术等实验手段，分析了PP-1的催化亚基在上述不同倍性鱼体内的表达模式：蛋白水平检测发现PP-1c在不同倍性鱼的大脑、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和性腺6种主要器官组织中均有表达，且不同的组织中显示了明显的差异表达模式，而PP-1c在这4种不同鱼的肌肉组织中的表达差异更显著，其中在异源四倍体鲫鲤中表达最低，在父/母本红鲫中的表达水平相对较高，子代三倍体湘云鲫中的表达最高,这种差异性可能从生化的角度说明了子代与父母本之间的变异性。免疫荧光组化实验结果显示，从整体水平来看，4种不同鱼的同一组织中，PP-1c的表达模式是非常相似的，这可能从蛋白和细胞的水平说明了异源四倍体鲫鲤与其二倍体父/母本及子代三倍体湘云鲫之间的遗传相似性。但对于同一组织的不同细胞的具体表达部位是有差异的，具有细胞特异性。     

人工诱导湘云金鳙雌核发育的研究

湘云金鳙的卵子经适宜UV剂量灭活处理的异源四倍体鲫鲤精子激活后,在4～6℃下冷休克11～13 min,抑制第二极体排出和第一次卵裂使染色体加倍,成功获得了极体雌核发育(meiG)和有丝分裂雌核发育(mitG)湘云金鳙二倍体个体.结果发现,用异源四倍体鲫鲤精子诱导获得meiG、mitG成活率可达到19.4％±2.3％和7.3％±1.9％.运用形态学测量、染色体计数和微卫星标记技术对雌核发育二倍体个体(meiG、mitG)进行了分析,其染色体数目为48;微卫星分析表明,雌核发育二倍体基因组完全来自于母本,没有受到父本染色体的污染,证实其为雌核发育二倍体.对雌核发育湘云金鳙性腺发育进行连续跟踪观察,所有雌核发育个体全为雌性,其中89％的个体的卵巢发育正常,为证明其雌性的性别决定类型为XX提供了证据.此外,雌核发育湘云金鳙F1的体色较普通湘云金鳙的体色偏红.雌核发育湘云金鳙的获得对其体色的稳定、种质资源的遗传改良和性别决定的研究等具有一定意义.     

不同倍性鱼的gnih和gnihr3差异表达分析

为研究促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone, GnIH)及其受体GnIHR在不同倍性鲫鲤生殖发育过程中的作用,实验通过PCR和RACE技术获得了二倍体红鲫和异源三倍体鲫的gnih、gnihr3基因c DNA全长。结果显示,2种鱼gnih基因编码的蛋白序列均含有GnIH肽典型的LPXRF标志,gnihr3基因编码的蛋白为含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。采用实时荧光定量PCR分析了2种鱼的gnih、gnihr3基因mRNA在不同组织中的表达情况,结果显示gnih基因主要在下丘脑中高表达;gnihr3基因在下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中都有不同程度的表达;此外,无论是非繁殖期或繁殖期,gnih基因在红鲫下丘脑中的表达量均高于异源三倍体鲫;同时,gnihr3基因在红鲫下丘脑和垂体中的表达量均高于异源三倍体鲫,但在卵巢中的表达则后者较高。利用组织原位杂交分析了gnih和gnihr3基因在2种鱼下丘脑和垂体的组织定位情况,结果发现,gnih基因在2种鱼脑中Npp、Npo、NLT区均有明显杂交信号;gnihr3基因主要定位在这2种鱼垂体的PPD、RPD区,NH和PI区杂交信号较弱;同时,gnih和gnihr3基因在异源三倍体鲫中的杂交信号比红鲫弱。研究表明,在下丘脑大量表达的GnIH,结合广泛分布于HPG轴的受体GnIHR,并通过多条途径参与调控性腺发育。gnih、 gnihr3mRNA在2鱼组织中的表达存在差异性,从分子水平提供了异源三倍体鱼不育的证据,在鱼类繁殖生物学和遗传育种方面具有重要意义。     

鲤、鲫杂交子代的同工酶分析

利用水平式淀粉凝胶电泳法对乌克兰鳞鲤(♀)×乌龙鲫四倍体(♂)、红鲫(♀)×乌龙鲫四倍体(♂)、红鲫(♀)×乌龙鲫二倍体(♂)、白鲫(♀)×墨龙鲤(♂)4组鲤鱼、鲫鱼杂交子代背侧肌肉组织的天冬氨酸转氨酶、α-甘油醛磷酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶及肌浆蛋白进行电泳分析,并测量了红细胞长径。红细胞测量结果表明,乌克兰鳞鲤(♀)×乌龙鲫四倍体(♂)、红鲫(♀)×乌龙鲫四倍体(♂)、红鲫(♀)×乌龙鲫二倍体(♂)杂交子代为三倍体,白鲫(♀)×墨龙鲤(♂)杂交子代为二倍体。4组杂交子代葡萄糖磷酸异构酶同工酶的基因组成结果显示,父本乌龙鲫四倍体和父本乌龙鲫二倍体均产生二倍体配子,且二倍体配子中1套为鲤鱼染色体组,1套为鲫鱼染色体组。     

二倍体雌核发育鲫鲤卵子发生的DNA含量和细胞学分析

以产生单倍体卵子的二倍体雌性红鲫为对照,对远缘杂交起源的二倍体雌核发育鲫鲤早期卵巢组织中的生殖细胞进行了流式细胞术分析,在此基础上结合组织学切片方法和染色体制片,对相应的卵巢组织细胞学观察和生殖细胞减数分裂特征进行了探讨.结果显示,雌核发育二倍体鲫鲤卵母细胞的DNA含量呈现两个主要的峰值,检测样本中的2号峰值显示的DNA含量是二倍体红鲫卵母细胞的1倍,代表减数分裂前染色体数未加倍的细胞群,其减数分裂Ⅰ前期分裂相呈现同源染色体部分配对,该细胞群在组织学切片上呈现空泡化等败育现象;另外,检测样本中的3号峰值显示的DNA含量是二倍体红鲫卵母细胞的2倍,代表减数分裂前染色体数已加倍的细胞群,其减数分裂Ⅰ前期分裂相呈现染色体数目加倍的完整的染色体配对,该细胞群由于染色体数加倍,可以越过杂种鱼的异源染色体之间的减数分裂配对障碍,正常发育为体积不断增大的初级卵母细胞,为产生后续的染色体数不减半的二倍体卵子奠定基础.该结果丰富了不减数配子的发生机制研究,在鱼类遗传育种方面具有重要意义.     

转基因三倍体湘云鲫养殖试验

由湖南师范大学生命科学学院与中国科学院水生生物研究所协议合作，将草鱼生长激素基因转移到三倍体鲫鱼进行研究。为检测经转移生长激素基因后的三倍体新鱼的养殖特性和生长情况，我们于2000年在长沙市水产科技推广站进行了转基因三倍体湘云鲫与普通三倍体湘云鲫专池对照养殖试验。1试验材料与试验养殖条件1.1试验材料先将草鱼激素全鱼基因移入异源四倍体鲫(鲤)，再将已整合了草鱼生长激素的四倍体雄鱼与日本白鲫雌鱼通过人工杂交而获得转基因三倍体湘云鲫夏花鱼种；对照鱼系同源未转基因的三倍体湘云鲫夏花鱼种。试验和对照夏花规格均为3…     

湘云鲫、湘云鲤的苗种培育

由于湘云鲫、湘云鲤均是由四倍体鱼父本与二倍体鲫鱼和鲤鱼母本通过人工杂交生产出来的三倍体鲫、鲤鱼,所以生产湘云鲫、湘云鲤鱼苗需要专业技术人员和专门设备进行生产。目前我国湘云鲫、湘云鲤都是由拥有湘云鲫、湘云鲤自主知识产权的湖南湘云生物科技有限公司所属苗种基地统一生产供应,广大生产者需谨防购进假冒伪劣苗种影响生产。湘云鲫、湘云鲤抗病力强,耐低温低氧较易养殖,按四大家鱼常规方法培育苗种即可。但苗种珍贵,如何提高苗种的成活率至关紧要,同时湘云鲫、鲤苗种培育阶段正值早春低温多雨季节,给苗种培育带来较大困难,必须结合…     

不同倍性鲫鲤MeCP2基因分子克隆及时空表达分析

为了探寻不同倍性鱼生殖育性的表观遗传调控规律,实验基于不同倍性鲫鲤精巢的转录本信息库设计引物克隆了不同倍性鲫鲤的MeCP2基因。序列比对结果发现,在远缘杂交的过程中基因组发生了遗传重组和变异。基于序列公共部分设计引物,通过半定量PCR和实时定量PCR的方法分析了MeCP2基因在不同倍性鱼发育过程中的时空表达特征。结果还发现,MeCP2基因在所有组织中都有表达,但在脑组织中的表达量最高;纵向对比性腺的发育过程,MeCP2基因的表达量会随着性腺发育成熟而下降;横向对比不同倍性鱼的性腺发育,MeCP2基因在三倍体鱼卵巢中的表达量明显高于二倍体和四倍体鱼,但在精巢中的表达量随鱼的倍性增加而增加。研究表明,MeCP2基因的表达与不同倍性鱼的卵巢发育密切相关,这为研究鱼类生殖不育的分子机理及其在水产育种上的应用奠定了坚实的基础。     

微卫星分离模式显示雄性三倍体鲫产生非整倍体精子

三倍体鲫(Carassius auratus)行天然雌核发育,其自然种群中却有较高比例的雄性个体,这些雄性个体的性腺发育正常,能产生有活力的精子。而且其精子的DNA含量约为体细胞的一半,显示三倍体鲫精子发生过程中可能经历了均等的减数分裂。流式细胞术虽然能够较准确地测定细胞群的平均DNA含量,但是却很难检测到单个精子中的个别染色体增减,要明确回答雄性三倍体鲫产生的精子是否为整倍体需要定量地检测单个精子的遗传组成。本研究用微卫星标记检测以雌性鲤(Cyprinus carpio)与雄性三倍体鲫为亲本构建的杂种家系的基因型,结果发现母本鲤的多态位点在子代中呈孟德尔分离,父本三倍体鲫具有三套鲫基因组,其等位基因在子代中呈随机分离。上述研究结果提示:三倍体鲫起源于二倍体鲫的同源加倍,而非二倍体鲫和鲤的种间杂交;三倍体鲫通过染色体的随机分离产生非整倍体的精子,其精子发生过程中没有均等的减数分裂。三倍体鲫行雌核发育生殖,却可能并非起源于种间杂交且群体中的雄性个体可育,因而是单性生殖鱼类中的一个特例。     

三倍体湘云鲫及其亲本线粒体DNA的比较研究

用人工选育的异源四倍体鲫鲤（♂）与白鲫（♀）杂交获得具有明显生长优势的三倍体湘云鲫。采用差速离心和核酸酶处理等方法，从三倍体、白鲫和异源四倍体鲫鲤肝组织中提取线粒体DNA，并用9种限制性内切酶进行单酶酶切分析。经琼脂糖凝胶电泳后计算出各酶切片段的大小，测得三倍体、白鲫和异源四倍体鲫鲤mtDNA的分子大小分别为16．24kb、16．60kb和16．20kb。根据各单倍型间的酶切片段共享度，估算出3个群体间的遗传距离，说明了mtDNA母系遗传的特性。     

同水体银鲫与普通鲫遗传多样性比较研究

通过2003年、2004年连续两年采样,用20对具有稳定扩增的银鲫微卫星引物对样品进行扩增,结果如下：2003年样品三倍体银鲫与二倍体鲫的平均杂合度分别为0．5885、0．6066；2004年样品两者的平均杂合度为0．5946、0．6091。2003年样品三倍体银鲫与二倍体鲫的遗传相似性系数为0．6331,两者的遗传距离为0．3669；2004年样品两者的遗传相似性系数为0．6173,遗传距离为0．3827。两年测定的结果显示三倍体银鲫的杂合度略低于二倍体鲫,两者的遗传距离较近,在所扩增的大部分微卫星位点上基因型相同或相似,其差异为种内差异,三倍体银鲫是鲫的一个特殊种群,在进化上,三倍体银鲫可能是从鲫分化而来的,是其在特殊的环境下的一种适应。     

鲤鲫杂交回交鲫染色体核型及DNA含量的分析

将性成熟的鲤鲫杂交鱼一代（F1）的雌鱼与雄性红鲫鱼杂交,获得了回交鲫子代,分析了平均体质量94.2g的1龄回交鲫子一代的细胞染色体核型,测定了其DNA含量。肾细胞直接制片法表明：回交鲫子代染色体由147条组成,即3n=147,NF=222,其核型公式为：3n=51m＋24sm＋27st＋45t。流式细胞记数法结果表明：在20尾鱼中有14尾回交鲫子代细胞的DNA含量是对照鱼（红鲫鱼）的1.5倍,占总鱼数的70%;6尾在2～3倍体之间,非常接近三倍体,占总鱼数的30%。本结果与其细胞染色体核型分析结果基本一致,说明该鱼是以三倍体为主的回交种。     

红鲫♀×乌龙鲫F_2(4n)♂回交F_1的倍性及黑体色表现的观察

观察和分析了红鲫(Carassius auratus auratus(red crucian carp))♀×乌龙鲫(Carassius auratus auratus(WuLong crucian carp))F2(4n)♂回交F1的倍性和黑体色个体的比例。结果显示:回交F1红细胞的长径为红鲫的1.28倍,红细胞核的长径为红鲫的1.41倍。回交F1为三倍体,回交F1的染色体数目为3n=150,核型公式为3n=51m+45sm+36st+18t,NF为246。回交F1体色全部为黑色。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析

在优化RAPD检测条件的基础上，从100个随机引物中筛选出60个扩增较好的引物对异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和湘江野鲤相互间扩增DNA片段的异同性进行比较研究。结果显示，60个引物共产生1554条带，单一引物扩增的DNA片段数在6～20条之间，片段大小在200～3500bp之间。遗传相似率分析表明，异源四倍体鲫鲤与其原始母本红鲫的相似率为69．41％，与其原始父本野鲤的相似率为64．47％，说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本红鲫的遗传物质要多一些；而红鲫和野鲤之间的相似率为42．18％，说明两者的基因组成有较大的相似性，从分子水平证实了红鲫和野鲤的远缘杂交具有较大的亲和性。在分析中，还发现异源四倍体鲫鲤有4条非亲本带，非亲本带谱率达0．72％，这些非亲本带可以作为异源四倍体鲫鲤特异性的分子标记。     

利用流式细胞仪鉴别转基因鲤鲫杂交回交子代的倍性

本文报道三倍体回交杂种的流式细胞仪测试方法和结果。取正常二倍体鲤鲫杂交鱼的体细胞液进样所得直方图为标准，通过对36尾鲤鲫杂交回交种和其雌核发育子代的细胞核DNA相对含量的测定，观察到杂种F1雌性回交子代中产生的三倍体和非整倍三倍体（2－3倍体之间）现象，测试结果以直方图表示。     

芙蓉鲫(芙蓉鲤♀×红鲫♂)及其原始亲本的形态学分析

本研究随机采集芙蓉鲫及其原始亲本(芙蓉鲤、红鲫、散鳞镜鲤、兴国红鲤),测定了7项可数性状和12项可量性状,研究芙蓉鲫与其原始亲本之间的表型差异。结果表明:芙蓉鲫(Cyprinus capiofurong.♀×Carassiusauratusred var.♂)可数性状稳定,介于父母本之间,可量性状中芙蓉鲫有5项偏向父本,3项偏向母本、4项超父母本。聚类分析显示芙蓉鲫可量性状更接近于父本红鲫,而与另3种亲本差异较远。判别分析结果也显示芙蓉鲫与红鲫形态更为接近,各组判别准确率依次为芙蓉鲫100%,红鲫96%,兴国红鲤87%,散鳞镜鲤81.3%,芙蓉鲤73.1%。