抗嗜水气单胞菌NJ-1感染的乳酸菌筛选及其免疫调节作用

为了筛选能提高水产动物对嗜水气单胞菌抗病性的益生菌,并研究其免疫调节的作用机制。将5种乳酸菌与斑马鱼ZF-4细胞共培养后通过荧光定量PCR方法检测细胞因子NFκB、TNF-α和IL-10的表达量,并用流式细胞仪检测被嗜水气单胞菌NJ-1攻毒后的细胞凋亡率来筛选对ZF-4细胞保护性最显著的乳酸菌,将其添加至模式生物斑马鱼饲料中饲喂28 d后,用嗜水气单胞菌NJ-1攻毒并检测斑马鱼肠道中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和抗炎性细胞因子IL-10的表达情况,并计算斑马鱼被攻毒后的累积死亡率。结果显示,5种乳酸菌分别与细胞共培养后,芽孢乳酸菌09.712能明显提高ZF-4细胞NFκB、TNF-α和IL-10的表达量,攻毒后细胞凋亡率降低至23.36%,与其他组相比存在显著性差异,所以选取芽孢乳酸菌09.712用于下一步实验。体内实验显示,攻毒后第1天,与对照组相比,芽孢乳酸菌09.712能显著促进斑马鱼肠道内IL-1β、TNF-α和IL-10的表达量,且随时间变化表达量减少;其中攻毒后第3天,菌饲喂组IL-1β表达量比对照组低,而IL-10表达量明显比对照组高。此外,芽孢乳酸菌09.712的饲喂显著降低斑马鱼攻毒后的死亡率。研究表明,芽孢乳酸菌09.712在体外能显著提高对细胞的保护性,在体内能诱导斑马鱼产生先天免疫应答,提高斑马鱼的免疫力,可作为预防水产动物疾病的理想选择,也为阐明乳酸菌先天性免疫调节作用提供理论基础。     

嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布

利用具有绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌(WJ-8G FP)对团头鲂(Megalobrama amblycephala)进行浸泡攻毒试验,探究温度对浸泡感染后嗜水气单胞菌在团头鲂各组织分布的影响。实验设立A组(水温25℃),B组(水温32℃),C组(水温25℃),其中C组为对照组。用菌株WJ-8G FP对实验组A、B进行浸泡攻毒,试验组C不进行攻毒处理,攻毒后分别于2 h、4 h、8 h、12 h、24 h采集各组鱼血液、脾、肾、鳃、肠道、肌肉,培养法统计分析各组织器官上的荧光细菌数量。实验结果显示,在各取样时间段实验组A(25℃)和实验组B(32℃)团头鲂各组织在均能检测到荧光嗜水气单胞菌,对照组未检测到嗜水气单胞菌;最高菌量出现在鳃,且鳃上嗜水气单胞菌数量显著大于其他组织(P0.05),其次是脾、肾;组织内的菌量随时间大体呈现先上升后下降的趋势;B实验组中各组织菌量显著大于A实验组(P0.05)。研究结果表明,鳃是嗜水气单胞菌浸泡感染团头鲂的主要组织器官,与25℃相比较,在水温32℃时团头鲂被嗜水气单胞菌感染的风险更高。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

嗜水气单胞菌感染对黄鳝hepcidin抗菌肽基因表达的影响

为了研究嗜水气单胞菌对黄鳝hepcidin抗菌肽基因表达的影响,用不同密度嗜水气单胞菌感染健康黄鳝后,采用荧光定量PCR方法分别检测染菌黄鳝肾脏hepcidin抗菌肽基因在感染后24h、48h、72h的表达量。试验结果表明,hepcidin基因在健康黄鳝中就有表达,腹腔注射嗜水气单胞菌后,该基因的表达量明显升高。随着处理时间的延长,处理菌密度较低组(0.5×108 cfu/mL)和较高组(2×108 cfu/mL和4×108 cfu/mL)黄鳝抗菌肽hepcidin基因的表达量都逐渐降低,只有菌密度为1×108cfu/mL时该基因的表达量是随着处理时间的延长而逐渐升高,但升高的幅度逐渐减小。密度为1×108 cfu/mL的嗜水气单胞菌能诱导黄鳝hepcidin抗菌肽基因表达量逐渐增加。     

DBP对斑马鱼肝脏和鳃SOD及ATPase酶活性的影响

以斑马鱼(Brachyclanio rerio)为实验材料,暴露于邻苯二甲酸二丁酯(DBP)5个浓度组中96 h,测得半致死浓度(96 h LC50)为8.51 mg/L,从而得出安全浓度0.85 mg/L。在此基础上,等对数浓度差设置4个质量浓度0.38、0.85、1.90、4.25 mg/L进行20 d的慢性染毒,期间每5 d测定斑马鱼肝脏、鳃中SOD酶和ATPase活性。结果表明,随DBP的浓度增大和作用时间增长,斑马鱼肝脏、鳃中SOD酶和ATPase活性均受到显著的抑制。     

大黄素、维生素C及其配伍对团头鲂感染嗜水气单胞菌后生理生化指标的影响

为综合评价大黄素、高剂量维生素C及其配伍对团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih)抗嗜水气单胞菌感染能力的影响,选取1 200尾健康的团头鲂,体质量为(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮,另外3组在基础日粮中分别添加60mg/kg大黄素、700 mg/kg维生素C、60mg/kg大黄素+700mg/kg维生素C(配伍组).饲养60 d后,经腹腔注射感染嗜水气单胞菌,并在攻毒前后检测团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏2种热休克蛋白70s(HSP70s)mRNA的表达水平;另从各池中取10尾鱼进行同样的攻毒试验,统计攻毒后各时间点鱼的累积死亡率.结果表明,攻毒后,与对照组相比,大黄素、维生素C组不同程度地提高了血清总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及HSC70和HSP70 mRNA的表达水平,降低了血清皮质醇(COR)、血糖(GLU)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、甘油三酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的水平;配伍组中,这些指标的变化趋势虽与上述类似,但大多与对照组的差异不显著(P＞0.05),且未表现出协同增效作用.此外,各组鱼血清胆固醇(CHOL)的含量在攻毒前后的差异均不显著(P＞0.05).统计也表明,大黄素和维生素C组鱼的累积死亡率在攻毒后24 h、48 h均显著低于对照组(P＜0.05),而配伍组试验鱼的累积死亡率与对照组差异均不显著(P＞0.05).由此可见,在基础日粮中添加大黄素60 mg/kg或维生素C 700 mg/kg,可提高鱼体的非特异性免疫力、抗氧化能力以及2种HSP70s mRNA的表达水平,增强鱼体抗病原菌感染的能力.二者配伍则效果不佳.     

不同水温条件下嗜水气单胞菌对鲫感染力的研究

通过注射攻毒的方式研究了15、20、25、30、35℃水温条件下嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对鲫(Carassius auratus gibelio)感染力。试验组每尾鱼(体重47.6 g±15.5 g)腹腔注射6×106cfu嗜水气单胞菌菌液,对照组注射等体积的无菌PBS。研究结果显示:在相同的试验条件下,水温35℃时发病最快,试验鱼出现典型的出血症状,死亡率高达100%;其次是30℃组和25℃组,死亡率均为76.67%;15℃组死亡率仅3.33%。此结果与天然条件下鲫鱼细菌性败血症的流行病学特征相吻合,为该病的预报与防控提供了科学依据。     

四种鲤鱼对柱形病抗病能力的差异

采用半致死浓度法,对4种鲤(东平湖鲤、建鲤、俄罗斯鲤及德国镜鲤)对柱状黄杆菌引起的柱形病(即烂鳃病)的抗病力进行了试验研究,分别采用1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105 cfu/mL浓度的柱状黄杆菌G4菌株菌液浸泡攻毒1h,参考Reed-Muench法计算半致死浓度(LC50)。结果表明,东平湖鲤LC50为104.7174 cfu/mL;建鲤LC50为104.6821 cfu/mL;俄罗斯鲤LC50为104.6414cfu/mL;镜鲤LC50为104.5694 cfu/mL,表明不同品种鲤鱼对柱形病的抗病能力存在差异,四种鲤抗病力大小依次为东平湖鲤建鲤俄罗斯鲤镜鲤,其中东平湖鲤和建鲤无显著差异,二者和镜鲤的差异极显著(P0.01)。     

甘露寡糖对草鱼感染嗜水气单胞菌后细胞因子表达的调节

在饲料中添加0.2%甘露寡糖(Mannan oligosaccharide,(MOS)),饲养草鱼(Ctenopharyngodon idellus)28 d后,草鱼经腹腔注射3.2×106cell/mL的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)0.1 mL,在注射嗜水气单胞菌48 h、72 h和96 h后,分别取草鱼头肾、脾脏和肝脏,利用荧光定量PCR分析甘露寡糖对草鱼感染嗜水气单胞菌后各组织中IL-1β和IL-10的表达影响。结果显示,在草鱼头肾中,MOS/I(0.2%甘露寡糖+注射Ah)组IL-1β的表达在注射嗜水气单胞菌后48 h和72 h显著高于CON/I(基础饲料+注射Ah)组;MOS/I组中1L-10的表达在注射嗜水气单胞菌72 h显著高于CON/I组,在96h时显著低于CON/I组。在草鱼脾脏中,MOS/I组IL-1β的表达在注射后72 h和96 h显著低于CON/I组;IL-10的表达在注射嗜水气单胞菌后48 h和96 h显著低于CON/I组。在草鱼肝脏中,MOS/I组IL-1β和IL-10的表达在注射嗜水气单胞菌后48 h显著高于CON/I组,但在注射后72 h时该2种基因的表达显著低于CON/I组。表明甘露寡糖在鱼体感染嗜水气单胞菌时能快速调节头肾、脾脏和肝脏中细胞因子的表达,增强鱼体抵抗细菌性病原的免疫力。     

鱼源植物乳杆菌HS-07胞外多糖对鲤的益生作用

为探究植物乳杆菌 HS-07 胞外多糖(exopolysaccharides from Lactbacillu plantarum HS-07, EPS-07)对鲤免疫、 抗氧化及抗嗜水气单胞菌感染能力的影响。将不同浓度的 EPS-07 (250 μg/mL、500 μg/mL 和 1000 μg/mL)与鲤头肾细胞体外共培养; 并设置对照组(灌喂无菌生理盐水)和 EPS-07 处理组(灌喂 250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL 的 EPS-07)进行体内实验, 1 次/d, 连续灌喂 7 d, 随后腹腔注射嗜水气单胞菌攻毒处理 24 h。体外结果显示, 鲤头肾细胞与 EPS-07 共同培养后, 其增殖能力、吞噬活性、上清液中一氧化氮(NO)的含量、促炎细胞因子[肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β (interleukin, IL-1β)、白介素-6 (IL-6)]和抗炎细胞因子[白介素-10 (IL-10)、转化生长因子-β (transforming growth factor, TGF-β)]的表达均显著增强(P<0.05)。体内实验结果显示, 嗜水气单胞菌感染前, EPS-07 处理组血清中 NO 的含量、促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达显著增强(P<0.05); 肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)含量, 以及超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 和过氧化氢酶(CAT)的活性均显著高于对照组(P<0.05), 但丙二醛(MDA)的含量显著低于对照组(P<0.05); 嗜水气单胞菌感染后, EPS-07 能抑制 NO 的大量释放, 上调抗炎细胞因子的表达和下调促炎细胞因子的表达。综上所述, EPS-07 在细胞水平和个体水平均能提高鲤免疫应答能力, 增强其抗氧化和抗细菌感染能力。     

Quantitative and qualitative studies on bacterial flora of hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) cultured in earthen ponds in Saudi Arabia

The bacterial flora of the rearing pond water and sediment as well as the gills and intestine of healthy hybrid tilapia cultured in Saudi Arabia was estimated quantitatively and qualitatively, the isolates being identified at genus or species level. Total viable counts of bacteria (measured as colony‐forming units, cfu) were in the range 5.6 ± 0.8 × 10³ to 2.4 ± 1.2 × 10⁴ cfu mL^?1 in pond water; 9.3 ± 1.1 × 10⁶ to 1.9 ± 1.5 × 10⁸ cfu g^?1 in sediment; 7.1 ± 0.7 × 10⁵ to 8.7 ± 1.1 × 10⁶ cfu g^?1 in the gills of tilapia; and 3.4 ± 1.8 × 10⁶ to 5.8 ± 0.4 × 10⁷ cfu g^?1 in the intestine of tilapia. In total, 15 bacterial genera and 18 species were identified. Pond water and sediment bacteria reflected the bacterial composition in the gills and intestine of tilapia. In contrast to gill bacteria, more diversification was observed in intestinal bacteria. Corynebacterium urealyticum, Shewanella putrefaciens and Aeromonas hydrophila predominated in all samples. In pond water, C. urealyticurn, S. putrefaciens, A. hydrophila, Flavobacterium sp. and Pseudomonas sp. were the most predominant bacterial species (prevalence > 10%), whereas A. hydrophila, C. urealyticum, S. putrefaciens and Escherichia coli were predominant in pond sediment, and C. urealyticum, S. putrefaciens and A. hydrophila were predominant in both the gills and intestine of tilapia.     

芽孢杆菌R1共培养对嗜水气单胞菌NJ-1毒力基因表达的影响

为探讨芽孢杆菌潜在的淬灭靶点,本研究通过芽孢杆菌R1与嗜水气单胞菌NJ-1共培养,并对NJ-1生物量、信号分子产生量、毒力因子基因和群体感应(QS)关键调控基因表达量进行检测。结果显示:1NJ-1单独培养时,信号分子BHL和HHL的产量与NJ-1生长趋势一致,在27 h时达到峰值并启动Lux R表达,进而调控毒力因子金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、肠毒素、气溶素和血溶素等表达,其在27~30 h时呈现峰值表达,通路Qse B在27~30 h启动表达,48 h时达到峰值,而种间调控Lux S基因表达一直处于低水平状态;2与芽孢杆菌R1共培养时,仅痕量AHLs信号分子被检出,毒力因子相关基因表达量均显著下调;Lux R表达受抑制,Lux S在36 h时表达量显著上调,未影响Qse B正常表达;3AHLs与R1共培养可被显著降解。研究表明,芽孢杆菌R1抑制NJ-1毒力因子相关基因表达可能与其对NJ-1多QS系统进行调控相关联。     

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。     

凝结芽孢杆菌对奥尼罗非鱼消化酶活性、消化率及生长性能的影响

在基础饲料中分别添加不同剂量的凝结芽孢杆菌(Ⅰ:1.0×1011cfu/kg饲料,Ⅱ:3.0×1011cfu/kg饲料,Ⅲ:6.0×1011cfu/kg),室外水族箱中饲养奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)(34.50±0.25 g),用基础饲料投喂作为对照,每饲料组设三个重复,每水族箱随机放养16尾鱼,投喂率为3%。采用静水饲养以避免各箱之间水的交换。56 d后测定鱼体的生长和消化酶活性。结果显示:不同添加量的凝结芽孢杆菌均能显著提高奥尼罗非鱼胃、肝胰脏和肠道蛋白酶活性(P<0.05),但酶的活性随添加量的提高呈下降趋势。凝结芽孢杆菌的添加对胃、肝胰脏和肠道淀粉酶及脂肪酶活性没有显著影响(P>0.05)。Ⅰ组和Ⅱ组的干物质表观消化率、蛋白质消化率、相对增重率、饵料系数和蛋白质效率均显著高于对照组(P<0.05),而Ⅲ组和对照组之间差异不显著(P>0.05)。结果提示,饲料中添加1.0×1011cfu/kg饲料的凝结芽孢杆菌就能显著促进奥尼罗非鱼的生长和饲料营养物质的利用,满足最佳生长。     

左旋咪唑对中华绒螯蟹非特异性免疫功能及抗病力的影响

为测定在饲料中添加左旋咪唑(LMS)对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的免疫调节作用,以0(对照)、100、200和300 mg·kg~(-1)干饲料的剂量将LMS添加于基础饲料中制成颗粒饲料,投喂中华绒螯蟹7 d,然后投喂不含LMS的对照组饲料。在投喂含LMS的饲料之前(0周)和投喂后2、4、6、8周,采样测定中华绒螯蟹的血细胞总量(THC)、不同血细胞数量(DHC)、吞噬活性、呼吸爆发(超氧阴离子的释放)、酚氧化酶(PO)活性和溶菌酶(LSZ)活性;并在投喂含LMS的饲料后的第4周,按1.2×10~7cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hyrophila)CL99920菌株,记录接种10d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,各LMS处理组的血细胞总量(THC)、透明细胞(HC)数量、吞噬百分率、呼吸爆发、PO活性和LSZ活性均显著地高于对照组(P<0.05);颗粒细胞(GC)数量、血细胞吞噬指数与对照组无显著差异(P>0.05);LMS处理组的蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。研究表明,饲喂适量的LMS可增强中华绒螯蟹的免疫力和抗病力;在本试验条件下,200 mg·kg~(-1)干饲料的剂量为最适添加剂量。     

支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌同时检测的PCR方法的建立

在已经建立的支气管败血波氏杆菌(Bb)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功建立在一个循环条件下同时检测3种细菌的PCR实验室诊断方法。利用一次PCR即可同时扩增出Bb的237bp、Pm的457bp,和HPS的821bp的特异性片段。该方法可检测到1.34×103cfu1/mLBb,1.6×102cfu/mLHPS,2.6×102cfu/mLPm。该方法的敏感性与已报道的各单项PCR方法的敏感性一致。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

The use of Pseudoalteromonas sp. F15 in larviculture of the Yesso scallop,Patinopecten yessoensis

A 49‐day rearing trial was conducted to investigate the effects of Pseudoalteromonas sp. F15 on growth, survival, digestive and immune‐related enzyme activities in larval and juvenile Yesso scallop, Patinopecten yessoensis. Larvae (Day 2 post‐fertilization) (d2 PF)) were provided with a diet only of microalgae (control) and supplemented with F15 at final concentrations of 1×10⁴ and 1×10⁶ cells/mL, respectively. Results indicated that the specific growth rates and survival rates of umbo larvae (d13 PF), crawling pediveliger larvae (d28 PF) and juveniles (d51 PF) fed the F15 supplementation diets at 10⁴ and/or 10⁶ cells/mL were significantly higher than those fed the diet of microalgae. Larvae and juveniles fed 10⁴ and/or 10⁶ cells/mL F15 supplementation diets showed a significant increase in pepsin, amylase and cellulase activities compared with the control group. The lysozyme, superoxide dismutase and catalase activities of larvae and juveniles fed the F15 supplementation diets at 10⁴ and/or 10⁶ cells/mL significantly increased compared to those fed the diet of microalgae. In addition, F15 protected juveniles against challenge with Vibrio splendidus. These data suggest that F15 can be useful in scallop larviculture.     

冰鲜大黄鱼加工过程中的细菌学分析及关键控制点

探讨了冰鲜大黄鱼加工过程中鱼体温度变化及细菌总数和主要腐败菌假单胞菌的变化,分析了加工中的关键控制点。活鱼、加工结束后中心温度超过8℃的鱼的细菌总数、假单胞菌数分别为5.5×104、4.5×104cfu/g和3.3×104、1.4×103cfu/g;加工结束后中心温度未超过8℃的鱼,细菌总数和假单胞菌数分别为9.6×103、3.8×103cfu/g;冰藏2d、5d后鱼的细菌总数、假单胞菌数分别为1.1×104、8.6×103cfu/g和2.4×103、5.6×103cfu/g。并从细菌学角度确定了原料鱼、冰、预冷却、运输、加工是冰鲜大黄鱼加工过程中的关键控制点。     

南京地区某渔场嗜水气单胞菌流行菌株的鉴定及分子分型

为确定南京地区某渔场异育银鲫出血性败血症的病原体,采集该渔场3个饲养塘口患病鱼脏器进行细菌分离培养,基于气单胞菌DNA促旋酶B亚单位(gyr B)基因序列设计引物,PCR扩增后测序进行细菌鉴定;同时,对病原菌生物学特性如溶血性、蛋白酶活性、生物被膜形成能力、运动能力以及对斑马鱼的毒力等进行分析,并进行多位点序列分型(MLST)。结果在3个饲养塘口均分离到嗜水气单胞菌,分别命名为GL-15、GL-17和GL-18;MLST分型显示三株分离菌均为ST251型;生物学特性实验表明,均有溶血性、蛋白酶活性以及运动性,生物被膜形成能力较强,OD595均超过0.5,对斑马鱼的LD50在1.4×103~3.9×103 CFU/尾,属强毒株。本研究为有效防控南京地区嗜水气单胞菌引发的出血性败血症的暴发流行提供了依据。