仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷...     

奥利亚罗非鱼DMT基因克隆与序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)睾丸DMT(DM-do-main gene in testis)基因,并进行序列测定与分析。结果表明,该基因cDNA序列全长1 260 bp,包括74 bp 5’非翻译区,879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区,阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明,不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性,显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析表明:DMT基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途中多种信号的调控。该基因的成功克隆及生物信息学分析不仅为DMRT1基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料,而且对进一步研究其编码蛋白的结构与功能以及其在鱼类性别调控中的作用具有重要意义。[中国水产科学,2007,14(1):23-31]     

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。     

斑节对虾亲环素A （cyclophilinA） 基因的克隆及启动子序列分析

通过同源克隆和RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)亲环素A(cyclophilin A,CYPA)的cDNA序列.根据已克隆的cDNA序列设计引物,利用染色体步移技术(Cenomic DNA walking)从斑节对虾卵巢组织中克隆了CYPA基因的启动子和基因组DNA序列.测序结果表明,斑节对虾亲环素A(PmCYPA)cDNA全长834 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为495 bp,可编码164个氨基酸;5'非编码区为31 bp,3'非编码区为308 bp.从斑节对虾基因组文库中扩增的CYPA基因组DNA全长3 181 bp,其中包括启动子区域1 173 bp,1个内含子426 bp,2个外显子序列:分别为101 bp和399bp.在5'UTR上游区域有明显的启动子序列,包含一个GC盒和2个CAAT盒,同时还包含AP1、CRE等调控元件,符合真核生物典型的启动子特征.分析基因的结构表明所克隆的PmCYPA符合PPlase家族成员特征,属于此基因家族成员.     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

海带hsp70基因的克隆、分析及转录水平定量研究

本研究以海带(Saccharina japonica)‘海天1号’为材料,通过RACE-PCR方法获得海带hsp70(Sjhsp70)基因全长cDNA序列。序列分析表明,全长cDNA长度为3778 bp,含有1个2892 bp的开放阅读框,5'和3'非编码区的长度分别为101、785 bp。蛋白质氨基酸含量和理化性质分析显示,该蛋白为稳定蛋白。应用BLASTP程序对不同物种HSP70蛋白比较分析表明,海带与长囊水云(Ectocarpus siliculosus)的HSP70蛋白具有较高的同源性,用HSP70蛋白构建的进化树显示,海带与长囊水云聚为一类。二级结构预测该蛋白由963个氨基酸组成,包含35个α螺旋和25个β折叠。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HSP110蛋白三维结构3C7N为模板,在I-TASSER软件上预测海带HSP70蛋白的三维结构,预测的蛋白结构与3C7N的A链在折叠和二级结构方面非常类似。对Sjhsp70基因在温度胁迫下表达变化分析表明,高温对Sjhsp70的表达量具有显著影响,Sjhsp70在25℃、24 h胁迫条件时,表达量达到最大值。本研究为阐明海带HSP70蛋白特性及其应对环境胁迫的机理提供理论依据。     

大鳍鳠免疫球蛋白M 重链基因的克隆及表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得大鳍鳠分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列.大鳍鳠sIgM的cDNA全长为1 992 bp,包含5 '非编码区53 bp,3’非编码区226 bp,开放阅读框1 713,编码570个氨基酸.推测的大鳍鳠sIgM蛋白质序列可变区含有4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR),恒定区(CH)含有CH1、CH2、CH3和CH4 4个部分.与其它6种硬骨鱼类IgM氨基酸序列比对分析表明,大鳍鳠sIgM存在半胱氨酸和色氨酸保守位点；其氨基酸序列与斑点叉尾鲴IgM的相似性最高,为54.3％；与石斑鱼的相似性最低,为24.6％.进化树分析表明,大鳍鳠sIgM与斑点叉尾鲴聚为一支.RT-PCR显示,大鳍鳠IgM基因主要在血细胞、脾脏、头肾和中肾中转录表达；注射嗜水气单胞菌后,血细胞、脾脏和头肾IgM重链基因转录表达量在1～10 d内有显著上升.     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)法分离出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784bp的全长eDNA,包括38bp5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167bp3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,推算的蛋白质分子量为59kD.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶(P450arom)具有70%以上的同源性,与其他鱼类脑P450arom有60%左右同源性,但其芳香化酶高保守区包括I-螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83%～96%、78%~86%和85% ～100%.系统发育分析表明,奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom,分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致.生物信息学分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白.同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基激化位点、N-肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点.使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼咸鱼各种组织中的表达.结果发现,P450aromA只在卵巢中表达.同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异,结果显示,鱼苗中无P450aromA的表达,成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍.     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

不同年龄细鳞鱼的繁育效果

研究了不同年龄组(3～8龄)细鳞鱼(Bachymystax lenok Pallas)亲鱼的繁育效果,分析其繁育主要技术,包括亲鱼培育、繁育技术、受精卵孵化、鱼苗培育等,结果发现,5～6龄和7～8龄细鳞鱼产卵量没有明显差异,产卵量、孵化率、出苗率均较高,繁殖效果明显好于3～4龄亲鱼。     

海口市近海渔业资源衰退的原因分析与对策建议

在分析海口市海洋渔业资源和海洋捕捞现状的基础上，提出了近海渔业资源衰退的6项原因和加快保护和修复资源的10项措施和建议。     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

Histopathology of respiratory organs of certain air-breathing fishes of India

Air-breathing fishes have evolved bimodal respiratory mechanisms for exploitation of water (through gills and highly vascularized skin) as well as atmospheric air (through aerial respiratory organs, ABO). Mucous cells in these respiratory organs of variously stressed fishes exhibit periodic fluctuations in their density and staining properties. The main types of damage in the gills include congestion of blood capillaries (BLCs), periodic lifting and sloughing of respiratory epithelia of the secondary lamellae causing haemorrhage, extensive fusion of secondary lamellae and hyperplasia of the respiratory epithelia due to uncontrolled regeneration leading to asphyxiation, altered excretion, and death of the fish. Haemolysis has also been observed following lead exposure. The damage in the ABO of Heteropneustes fossilis includes sloughing of the epithelial cells, leading to haemorrhage causing decreased red blood corpuscles density and degeneration of the secondary gill lamellae with reduced respiratory area. Subsequent hyperplasia of the respiratory epithelia and fusion of gill lamellae increase the respiratory barrier distance. The BLCs often bulge out and protrude into the lumen, bringing blood nearer to air. The ladder-like pillar cell (PLC)-BLC components of the gill lamellae frequently collapse. Damage to the ABO of Channa striata is less severe. Often haemorrhaging due to bursting of extensively stretched BLCs causes aerial respiratory failure. Chloride cells of the ABOs also show hyperplasia. While the highly mucogenic epidermis of C. striata shows less damage, the epidermis of Clarias batrachus and H. fossilis shows severe wear and tear, sloughing, and haemorrhage. Side-by-side regeneration continues, causing altered histomorphology of the epidermis. The different gland cells also show periodic fluctuations in their density and staining. The dermis also shows severe damage with loosening of their connective tissue fibres. These fibres give stronger reactions for sulfated mucin that not only retain additional water molecules for continuance of skin breathing, but also bind the toxic ambient pollutants.